在体外受精是已经转化的不孕药领域的技术。在过去的几十年中，尽管出现许多与试管婴儿相关的干预措施，但与引入植入前基因检测相比，无论是专业人士还是整个社会，很少有人获得更多的关注。PGT当前最常用的应用是通过非整倍性测试。在人类怀孕自发流产都记录到与染色体非整倍高度相关。非整倍性是繁殖障碍的整个自然界最常见的原因。引入PGS可以最大程度地减少进行IVF的不育患者人群中的非整倍体妊娠。PGS是一种程序，其中可以从培养的早期胚胎中对细胞进行活检，并在子宫转移之前测试其染色体互补性。因此，PGS试图鉴定整倍体胚胎以用于子宫转移，从而既增加了植入率又降低与IVF相关的流产率。在过去10到15年中，与PGS相关的数据变化很大。通常，从5-10年前的PGS试验获得的数据与最近几年进行的PGS试验产生的数据显着不同。这些差异很可能是由于PGS的应用随着时间的推移获得巨大的进步以及测试胚泡的能力。这篇综述将简要概述PGS的发展以及当前的使用建议。此外，本文还将概述当前用于执行PGS的各种技术，以及它们的相对优缺点。
1990年，第一个成功的PGT程序由AlanHandyside博士进行。该病例利用Y染色体的鉴定来降低已知患有X连锁隐性疾病的孩子在母亲中的机会。后不久这种情况下，遗传学家开始尝试从卵裂期胚胎是单个卵裂球或极性体[使用荧光原位杂交三条染色体PGS。这样做是为了减少自发流产或遗传综合征婴儿的风险。随着时间的推移，FISH用于鉴定非整倍体为12组或更多的染色体。这些早期技术的初步数据在生殖医学领域引起了极大的兴趣。然而，在2007年发表在新英格兰医学杂志的前瞻性和随机研究未能表现出与PGS相关的怀孕率增加。继这份报告之后，其他研究未能证明PGS对妊娠结局有好处。随后，包括美国生殖医学学会，美国妇产科学院和欧洲人类生殖与胚胎学学会在内的多个主要专业学会都发布了正式意见，这些意见阻碍PGS的普遍使用。在利用卵裂期胚胎和极体活检进行的与FISH相关的令人沮丧的结果之后，遗传学家，医师和胚胎学家开始开发并利用可显着改变PGS工艺的新工具和技术。当前执行PGS的方式取得几项重大进步，促进了这种范式转换，包括以下内容：1。同时评估所有23对染色体的倍性状态的能力2。进行滋养外胚层活检的能力3。活检后玻璃化胚胎的能力，一个明显益处利用23号染色体对评价在滋养外胚层阶段PGS已被证明在多种前瞻性随机试验。此外，PGS活检后使用胚胎玻璃化技术使PGS的处理过程具有更大的灵活性，从而导致该技术的利用增加，尤其是在美国。在研究证明PGS的益处评价患者人群有很多，包括复发性流产和不明原因的不孕症。近年来，PGS的临床利用率已经大大提高，并且这种趋势在可预见的未来很可能会继续。ASRM实践委员会于2016年3月发表关于非整倍体植入前基因筛选的简短交流。这表明“将PGS用作IVF的通用筛查测试可能显示出更高的活产率，并增加选择性单胚移植的利用率。”这是国际专业委员会的第一条建议，指出PGS具有较高的活产率，应考虑减少多胎妊娠。
如前所述，与采用卵裂期或极体活检的FISH评估相比，目前推荐使用PGP进行23染色体对评估并进行滋养外层活检的方式，目前推荐进行PGS的方式存在几个主要差异。这些差异中最显着的也许是最新技术能够可靠地识别所有23对染色体上的非整倍性。在FISH评价，只是染色体的离散数量可以评估，通常一次9-12染色体。妊娠失败的早期流产数据表明，某些染色体比非整倍体妊娠更有可能涉及其他染色体。因此，在PGS的早期许多专家认为，专注于“问题染色体”将使他们能够识别与非整倍性相关的主要染色体。然而，最近从胚胎DNA的23条染色体评估获得的数据显示，在所有23条染色体对中，非整倍性分布相对相等。因此，无法在所有23个染色体对中检测非整倍性的技术在识别非整倍性方面处于明显的劣势，因为许多非整倍性错误将不会通过使用该技术进行评估而在染色体上进行。与在卵裂期或极体活检中进行的活检相反，滋养外胚层活检的另一个重要进展是。这种变化导致结果成功的改善有几个原因。这些原因中最相关的一个是胚胎镶嵌症。在许多胚胎中，有多种不同的细胞系-一种称为镶嵌症的状况。这意味着，所有单元格都源自共同的初始划分的概念不能完全准确。因此，并非所有非整倍体错误都源于减数分裂的非分离，并且受精后必须发生一些倍性状态变化。数据报道在卵裂发育阶段的镶嵌率高达50％。而嵌合并在滋养外胚层阶段持续，嵌合的速率是显着低，在发展早期阶段近似3-5％，因此有可能在PGS期间进行活检和测试的细胞可能无法代表构成胚胎的其他细胞的倍性状态。镶嵌术可能会导致临床误诊，即使在已经进行准确的细胞遗传学诊断的情况下，该结果也可能与临床结果不匹配。从逻辑上讲，与存在较高镶嵌率的早期发育阶段相比，胚泡阶段存在较低镶嵌率的滋养层活检可以更准确地预测胚胎内的细胞优势。除固有的较高的临床误诊率外，卵裂期的PGS活检与滋养外胚层活检相比，对胚胎发育具有有害作用。评估卵裂期胚胎活检的影响的数据显示，显着的发育滞后与活检过程本身有关。因此，就诊断准确性和胚胎创伤而言，卵裂期活检不如滋养外胚层活检。
即使评估在滋养外胚层阶段进行的胚胎活检并评估全部23对染色体，也不确定实现和维持妊娠的可能性。其他因素，例如线粒体拷贝数与核DNA的比例改变，表明胚胎处于应激状态，从头开始具有临床意义的缺失或重复，自身免疫因素，子宫内膜容受性，内分泌异常，解剖异常或其他因素目前未知或不确定，可能在维持妊娠中起作用。但是，尽管事实上在植入和胎儿早期发育过程中涉及多个变量，但倍性状态仍然是成功妊娠的重要且必要的组成部分。的是，虽然胎儿非整倍的发生率可与PGS可以减小PGS数据清楚地表明，它不能被完全利用现有技术在很大程度上是由于胚胎镶嵌消除。当前的诊断技术测试注定要成为胎盘的细胞，而不是分化为胎儿的内部细胞团的细胞。出于对胎儿未来分化的担忧，不建议对内部细胞团进行活检。镶嵌可以存在于构成滋养外胚层的细胞内。鉴定滋养外胚层中非整倍体或整倍体镶嵌的能力提出重大挑战，并且已经实施克服该问题的策略。一种策略是对大约5-10个细胞进行活检，并使用能够在此级别识别镶嵌的检测技术。但是，必须权衡从活检过程中诱发的胚胎创伤，以决定如何积极地进行滋养外胚层活检。改善IVF/PGS临床结果的另一个重要因素是要了解，所有非整倍性的基因检测都不相同。适当地验证，所有遗传技术将同样识别“全染色体”非整倍体。然而，在除了提供全染色体非整倍体的一些遗传技术也能够识别大节段性染色体复制或缺失的。新的和增强的遗传技术将提供全染色体非整倍体和大型节段性德尔斯或DUP的标识和线粒体的拷贝数，并且还可以同时识别从头临床显著德尔斯和DUP的。因此，订购医生必须解“所有非整倍性测试技术都不相同。医生应该对每种技术的利弊有一个清晰的认识，以便使患者获得可行的怀孕和健康婴儿的机会。
许多生殖医学医师面临的共同挑战是在执行PGS测试时使用哪个基因诊断平台和哪个公司。有某些诊断技术，例如FISH，根据当前医学文献不建议使用。能够测试所有23对染色体的所有诊断测试平台在识别整个染色体非整倍性方面具有可比的功效，但是在同时识别其他结构染色体异常或线粒体拷贝数方面的能力差异很大。此外，某些诊断测试平台还可以同时测试染色体畸变和单基因突变。以下摘要概述了通常用于PGS基因诊断技术的每个平台。在早期到2000年代中期，实验室开始研发新技术提供的能力测试所有23双非整倍体染色体，结构性染色体畸变同时测试。基因检测有两种主要类型的微阵列。这些是单核苷酸多态性和比较基因组杂交阵列。SNP和CGH之间的差异很大。对于这两个微阵列平台，必须通过提供整个基因组覆盖范围的某种类型的DNA扩增方案来溶解并扩增滋养外胚层细胞。与任何基因检测一样，诊断结果的质量始于扩增的DNA样品的质量。SNP是基因组DNA中成对的单核苷酸对，它们在给定物种内高度可变。在PGS的背景下，所评估的SNP通常在基因组的非外显子编码片段中。在PGSSNP微阵列典型地评估大约300,000个SNP在整个基因组隔开。SNP阵列为每个分析的样品提供一个基因型，并将结果与人类hapmap参考基因组进行比较。这些阵列可以识别整个染色体非整倍性，还可以识别整个基因组中大约250个常见的结构染色体畸变。但还有数百种从头开始的结构染色体异常，这异常低于用于PGS的300,000个SNP阵列的分辨率，可能在植入，流产或生育患有严重遗传综合征的婴儿中发挥重要作用。由于提供基因型信息，因此SNP阵列识别三倍体的能力有限，但可以识别单亲二体性。如果分析足够的滋养外胚层细胞，SNP阵列也可以识别镶嵌。参考实验室对用于PGS的SNP阵列的限制之一是，当夫妻有亲戚关系时，它们的算法无法识别拷贝数。因此，如果两个伴侣之间存在任何血缘关系，则不会报告非整倍性结果。
CGH芯片的密度低于SNP芯片。用于PGS的aCGH芯片在整个基因组中有大约4000个标记。的aCGH是其中临床样品相对于正常46，XY和46，XXDNA样品比标记方案。与SNP阵列相比，CGH阵列能够在较短的时间内完成。CGH阵列平台能够在短短的12-15小时内扩增DNA并完成整个分析。与SNP阵列相比，这是一个重大优势，SNP阵列需要大约30到40小时才能完成分析。没有产生SNP阵列中产生的基因型，因此aCGH无法区分46，XX与69，XXX或46，XY与69，XXY。aCGH无法识别单亲二体性。所有商业实验室用于PGS的aCGH只能识别整个染色体非整倍性，并且没有经过设计或验证无法识别结构染色体畸变。如果aCGH芯片针对镶嵌细胞样本进行验证，则aCGH确实不能鉴定滋养外胚层样本内的镶嵌性。aCGH的错误率大约为15％至30％。在实验室进行的验证研究中，通过对400多个滋养外胚层样品中的下一代测序DNA与aCGH进行比较，结果表明一致性率大于99％。在该验证研究中，通过aCGH在边缘三体性19三体症之间进行一次不一致诊断，该诊断被下一代测序诊断为正常。定量PCR或实时PCR是聚合酶链式反应测定，其可以通过检测每个染色体的拷贝数识别全染色体非整倍性分析。它通过将每个染色体上的三个或四个基因座特异性扩增子与同一染色体上的参考基因进行比较来实现此目的。此测定法可容易地识别非整倍体用于以快速的方式所有23对染色体，但它是非常劳动密集和自动化强烈推荐。qPCR无法准确识别结构染色体畸变，但可以识别三倍体。由于定量PCR不产生基因型，它无法识别单亲二体。可以包括一个单独的实验设计来检测线粒体的拷贝数。下一代测序是需要优化的DNA扩增，以减少在扩增过程引入伪像的技术。DNA扩增后，可通过生物信息学软件识别并去除伪影。
当前有两个主要平台用于PGT。DNA扩增后，将每个DNA样品约50ng酶解成数百万个片段，并合并用于文库制备。文库制备是将所有DNA片段与衔接子和条形码融合在一起的方法。健壮的文库可产生代表性的，无偏差的核酸表示形式，对于准确的分子分析至关重要。文库制备后，完成乳液PCR步骤或完成桥接PCR步骤。完成这些步骤后，DNA片段的实际测序存在显着差异。
对于MiSeq会发生基于光学的合成测序。PGM使用离子敏感场效应，当通过DNA合成进行测序时，可以检测到由DNA聚合酶释放的离子。这是基于每次加入核苷酸三磷酸时都会发生的氢离子的释放。质子的释放会导致pH值发生轻微变化，这会被敏感的传感器检测到。MiSeq和PGM都以大约1倍的深度对整个基因组进行测序，并将测序数据与人类hapmap参考基因组进行比较。这两个平台都允许一次同时分析22至60DNA样品。两个平台均可在13至16小时内完成分析。进行测序分析后，MiSeq与PGM数据输出和分析之间存在显着差异。MiSeqDNA经过第一轮质量保证指标，然后使用BlueFuse软件进行详细分析。使用Torrent浏览器对PGMDNA输出进行第一轮质量保证指标，然后通过IonReporter软件进行详细分析。MiSeq可以识别整个染色体非整倍性，但仅用于识别整个染色体非整倍性。如在技术公告规范使用关于MiSeq其VeriSeq基因组分析PGS指出，“VeriSeq仅旨在检测全基因组非整倍性和马赛克下降到50％的电平”。不应将其用于检测任何结构染色体异常。MiSeq还可以识别线粒体拷贝数。与此相反，PGM分析可以识别全染色体非整倍体，大德尔斯或DUP的，且临床显著德尔斯或向下的DUP到大约800kb的分辨率为1MB。PGM还可以识别到大约20％的水平和线粒体拷贝数的镶嵌。公平地说，一些使用MiSeq的商业实验室确实报告较大的结构染色体异常和镶嵌现象，含量低于50％。此外，使用PGM的实验室仅报告非整倍性的拷贝数，没有结构性染色体畸变或镶嵌现象。PGM和MiSeq都可以测试单基因突变。由一个参考实验室提供的另一种使用MiSeqNGS平台的变体，称为低密度NGS或LD-NGS，采用的NGS技术的分辨率低于该NGS技术。他们的DNA扩增方案不同于整个基因组扩增方案，因为它们在整个基因组中扩增大约10,000个基因组位点。完成后，将对这些扩增产物进行下一代测序。这种NGS方法论可在每个基因座处提供测序信息，但不能在每个基因座之间提供测序信息。此参考实验室技术仅针对整个染色体非整倍性或临床上显着的dels或dups进行验证。这种方法也无法检测镶嵌。如果大约50％的样品是花叶，则将其分类为异常，而不是花叶异常。至关重要的是，推荐诊断平台的医疗保健提供者必须了解可用的NGS技术之间的差异，并且绝对不能“假设”它们都是平等的。
PGS是优化辅助生殖技术的强大新工具。在过去的十年中，PGS的执行方式已大大成熟和改进。当前的医学文献支持PGS在许多患者人群中改善ART结果的观点。当前的建议支持使用进行PGS时通过滋养外胚层活检评估在胚泡期所有23对染色体的倍性状态的技术的使用。需要以直接比较的方式评估数据的未来研究，以更完整地定义PGS当前使用的不同诊断技术的相对优点。PGS正在成为通过辅助生殖技术提高妊娠成功率的最有价值的工具之一。新兴的结果复杂性，尤其是在使用更复杂的工具的情况下，可能会导致在未来几年中以不同的方式获得PGS结果。由于在NGS结果中量化镶嵌率，因此当没有整倍体胚胎可用时，可以考虑将非存活染色体的镶嵌转移。可以想像在不久的将来给出PGS结果并确定所有镶嵌率的时间，并且除了明确建议是否转移外，还有一个“中间类别”，其中一些具有非整倍体或整倍体镶嵌的胚胎当没有整倍体胚胎时，可以考虑转移。在这种情况下应就此类转移的含义向患者提供广泛的咨询。同样，倍性的类型将非常重要，可能使用非致命的非整倍体-整倍体镶嵌体，例如考虑将胚胎隐匿在46，XX/46，XXY或46级，XY/47，XYY左右考虑进行子宫转移的任何具有可行遗传综合征花叶的胚胎。如果没有整倍体胚胎可用于转移，还可以考虑所有致死性染色体的转移。实验室采用SNP和CGH微阵列，qPCR分析以及MiSeq和PGMNGS平台。最终，应根据临床和患者的需求来个性化选择使用哪种诊断平台。 |
