皮肤科医生与基因检测 |
在过去的几十年中，基因测试取得了令人难以置信的进步。自2003年4月完成人类基因组计划以来，发现疾病遗传基础的发现激增。最终，有可能对患者的基因组进行测序，不仅可以识别遗传疾病，还可以识别复杂的多因素疾病的易感性，针对该个体的最佳治疗选择，以及预测患者对特定药物遗传学干预的反应方式。这种现象将影响医学的各个领域，皮肤科医生有机会站在这个新时代的最前沿。皮肤通常充当遗传疾病的窗口，也为研究镶嵌术提供了绝佳机会。考虑到进行皮肤活检的实用性，皮肤科医生不仅可以获取血液和颊涂片样本，还可以获取实际受影响的皮肤组织进行分析。因此自从1977年首次提出DNA测序以来，它已经走了很长一段路。新的“下一代”测序技术现已可用于产生快速结果，而成本却迅速下降。NGS技术取代了通过设计每个外显子特异性引物来一次测序一个基因的Sanger方法，而是将DNA分解成许多较小的片段，这些片段迅速平行扩增，然后重新排列在一起，形成最终序列。有多种方法可以完成此操作，但所有方法都具有相同的基本方法。NGS的困难之一是，由于比对过程，DNA内的结构变异可能会丢失，包括除单核苷酸变异以外的DNA改变。减少这种错误的几种策略已被描述。NGS可用于许多不同类型的研究中，如下所述。
自1900年代初期对其进行初步描述以来，连锁分析以及随后的DNA测序一直是发现导致疾病的新基因的传统方法。尽管比今天的标准慢且昂贵，但是使用这些技术已取得了重大发现，包括描述了导致诸如囊性纤维化和镰状细胞性贫血等疾病的基因。用最基本的术语来说，连锁分析是研究DNA基因座如何相对彼此分离以及与染色体区域相关的可识别表型的分离。它们越接近，它们越有可能在细胞分裂过程中通过重组过程被携带在一起。选择患有孟德尔病的家庭进行研究，并确定受影响的个体。沿着基因组的长度选择标记等位基因。然后通过确定比值对数分数，进行分析以确定哪些标记等位基因与目标表型相关。传统上，高于3的LOD分数被认为是联系的证据，而低于2的LOD分数被认为是阻止联系的证据，尽管这些界限是任意的，并且可以根据所研究的疾病而改变。对表型有重大影响的等位基因最好进行连锁分析，尽管这些类型的“大影响”等位基因很少见。一旦在一个家庭中确定了特定染色体上的感兴趣区域，就需要确认其他谱系之间的联系。这可能很困难，尤其是在遗传复杂的疾病中，因为不同的基因座可能与不同家族的表型有关。进行连锁分析的另一个挑战是，要达到显着性的LOD分数，需要有许多具有表型的家庭成员的大血统书或许多较小的血统书。使用连锁分析发现了导致Kindler综合征的基因FERMT1。尽管这种病很少见，但在巴拿马海岸附近发现了一个孤立的美洲原住民部落，有26个受影响的成员，这使这项研究成为可能。链接分析仍然是一个强大的工具，尤其是与其他技术结合使用时。例如，使用连锁分析确定的候选区域很大，过去分析起来既昂贵又费时，但是通过将NGS与连锁分析结合起来，可以轻松地分析这些大型候选区域。
对于常见的多基因疾病，例如2型糖尿病，肥胖症和克罗恩氏病，全基因组关联研究已证明是有帮助的。GWAS扫描大量患有特定疾病的患者的DNA，以寻找单核苷酸多态性。SNP是DNA中单个核苷酸的变化。人类基因组计划和国际HapMap项目的完成使这些研究成为可能。这些是包含基准人类基因组和常见的遗传变异的地图在大群体大型数据库。GWAS通过收集来自具有一定表型的大批患者的DNA并进行分析来确定是否存在SNP，即受影响患者中的SNP是否比来自种族相似人群的对照组中的SNP多。在GWAS中发现的这些相关SNP标记了基因组区域，这些区域会影响发生所研究疾病的风险。然后进行进一步的分析，例如DNA测序，以鉴定潜在的病因基因。
全基因组关联研究对常见疾病的研究最有帮助，因为需要分析大量患者。它们还有助于尝试识别可能导致发生遗传复杂疾病风险的众多不同遗传变异。同样，在这些通常难以治疗的情况下，这可能为靶向治疗提供许多基因。此外，在这些研究中，不仅对外显子组，还对整个基因组进行了扫描，这也使得内含子内的变异也可以被检测到，而其他类型的研究可能会忽略这些变异。GWASs的一个缺点是，很多SNP位点通常发现的，但很多只对疾病的影响不大。在大多数情况下，GWAS不受数据获取的限制，而受这些数据的分析的限制。在某些情况下，可能存在未发现的常见遗传变异。如果遗传变异对表型的影响很小，则样本量可能太小而无法获得足够的功效。因此，在疾病是由于罕见的遗传变异导致的情况下，全外显子组或全基因组测序可能更具成本效益。最后，低频遗传变异也可能难以检测。1000个基因组计划是一个大型数据库，可检测拷贝数多态性，其他结构变异和SNP，已于2010年完成并发布，并将继续更新。这将大大增强对LFGV的研究。最早发表的GWAS于2005年发表于黄斑变性患者中。自那时以来，已有1000多项研究报告。最近使用这种方法研究的皮肤疾病包括基底细胞癌，斑秃，牛皮癣和特应性皮炎。用于皮肤基底细胞癌的一个GWAS基于通路的方法在2001年。通过这样做，发现了四个以前未知的与BCC风险相关的途径。在斑秃患者中进行的GWAS揭示了139个与疾病表型相关的SNP。发现许多这些SNP与先天和后天免疫途径有关，以及新描述的在毛囊本身中上调的配体有关。
各种对比研究已经证明，结构变化，而不是单核苷酸的点突变有助于大多数人基因组之间的碱基对差异。结构变体包括缺失，重复，倒位，易位和插入。CNVs具体定义为DNA的不平衡结构变体或片段，可改变二倍体参考基因组中碱基对的数量。1kb的DNA片段大小或更长筛选的CNV时通常被用作截止，但是技术上的重大改进已允许检测较小的事件，将大于50bp的大小合并到定义中。用于检测CNV的方法包括基于阵列的CNV调用和NGS。阵列CGH涉及荧光标记的疾病和参考样品与已建立的靶DNA序列的杂交，以及信号杂交比的评估以评估拷贝数。SNP微阵列与阵列CGH的不同之处在于，它们将片段化的疾病DNA样品直接应用于阵列，并靶向特定于单个核苷酸差异的DNA序列。与CGH相比，SNP微阵列具有能够检测杂合性缺失的优势。最后，NGS将序列结果与参考基因组进行比较，以鉴定变异体。
分析CNV在疾病发展中的作用具有许多优势，因为CNV遍布整个人类基因组并影响众多基因。CNV也可能导致常见的复杂疾病，并导致无法通过使用GWAS发现的易感基因座解释“遗传性缺失”。基于杂交和下一代测序技术的改进也使CNV的检测更加经济实惠。相反，CNV分析的一个主要缺点是将疾病CNV与原本不受影响的人群中常见的多态性变异区分开来。鉴于无法获得解释结构变异完整光谱的人类参考基因组，这一任务尤其具有挑战性。皮肤病学感兴趣的是，最近将CNV分析应用于调查丝聚蛋白基因内的CNV是否会引起特应性皮炎的疾病风险。发现FLG中的CNV对特应性皮炎风险具有显着的剂量依赖性作用，这种作用与先前确定的FLG功能丧失突变无关。CNV也与牛皮癣有关。LCE3B和LCE3C的缺失被鉴定并被证实在两项研究中，银屑病患者的等位基因缺失频率高于对照组。在进行这些CNV研究之前，使用GWASs在LCE基因簇中发现了易感基因座。GWAS和CNV研究相结合，已经成功地鉴定了与这种皮肤病相关的基因，这再次表明CNV可能解释了GWAS无法解释的“遗传力缺失”。
外显子组和WGS可用于研究罕见疾病，因为只需要少数病例或家庭。时间和金钱的限制以前限制了这些技术，但是现在，使用NGS，它们变得越来越可用和流行。在这两种情况下，对患病患者的DNA进行测序，并与国际数据库或其父母的种族相似对照进行比较，以从头鉴定新变异或新变异。通常会发现许多变体，因此要确定哪些是致病因素可能会很困难。通常，在基因外部或没有已知功能的基因中发现变体，这使得评估变得困难。最近，这些技术已用于研究镶嵌异常。在这些情况下，患者外显子组测序与WGS之间的主要区别在于被测序的基因组部分。外显子组测序比WGS稍快且便宜，因为仅对外显子进行了测序。这约占总基因组DNA的1％。通过设计，不分析DNA的非编码部分。尽管如此，外显子组测序仍然是一个强大的工具。已发现与疾病相关的大多数等位基因涉及蛋白质编码序列的破坏。外显子组测序的另一个挑战是确定哪些DNA片段确实是外显子组的一部分。随着NGS的广泛应用，大多数实验室已经从最初的已知编码蛋白质的保守基因组转移到了越来越多的假设性蛋白质编码序列上。因此，外显子组是开始寻找对罕见病具有大表型效应的微小DNA改变的好地方。
全基因组测序使用NGS检查整个基因组DNA。这不仅包括外显子，还允许研究内含子中的重要序列，例如微RNA，启动子区域和超保守元件。以前认为基因组的这些部分主要是“垃圾”，但对于理解疾病的遗传力可能至关重要。DNA的许多这些区域都参与外显子表达的调节或DNA的结构稳定性。仅限于外显子组测序等较窄重点的研究通常将其排除在外。WGS是对DNA的最全面的研究，但过去一直受成本和完成测序所需时间的限制。有了NGS技术，这也可能有助于发现GWAS尚未发现的某些“遗漏遗传”。作为发现稀有疾病遗传原因的好工具，用于皮肤病的外显子组测序和WGS研究已经成功。最近使用全外显子测序在Olmsted综合征患者中鉴定出TRPV3突变。最近的另一篇报道使用外显子组测序发现CHST8内的突变，导致常染色体隐性剥脱性皮肤综合征A型。外显子测序也导致体细胞突变的第一次报告IDH1和IDH2造成Maffucci和Ollier综合征疾病的。连锁分析，WGS和靶向Sanger测序相结合，可用于描述感冒性荨麻疹，免疫缺陷和自身免疫性家族中PCLG2的缺失。
所有上述基因发现技术都依赖于DNA序列变化的存在。在某些疾病中，DNA序列保持完整，但是会发生一些修饰，影响基因表达并最终影响表型。这些修饰统称为表观遗传学，是许多研究人员关注的一个快速扩展的领域。表观遗传的变化包括胞嘧啶修饰，组蛋白修饰和非蛋白质编码RNA片段。DNA甲基化发生在胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对上并导致转录沉默。这最经常发生在基因的启动子区域。研究DNA甲基化模式不同于DNA测序，因为传统的DNA测序技术会破坏甲基化模式。以前，甲基化研究仅限于选择基因组区域。随着NGS的出现，单碱基对分辨率的全基因组DNA甲基化分析现在成为可能。甲基化模式已经出现了皮肤病，但最近已为黑色素瘤和牛皮癣描述。另一个表观遗传过程，组蛋白修饰，也可能导致DNA表达改变。可以鉴定和测序与特定修饰组蛋白结合的DNA的免疫沉淀。组蛋白修饰已开始在皮肤病中揭开面纱，这些疾病被认为具有环境成分，例如斑秃。表观遗传学的这些领域正在迅速发展，但是还有很多地方需要学习。
作为皮肤科医生，肿瘤基因检测网观察到的马赛克现象可能比其他任何专家都多首先注意到并绘制了皮肤中的这些模式，这些模式现在被认为是胚胎发育过程中细胞的迁移路径。具有线性模式的许多皮肤病是体细胞镶嵌或lyonization的结果。当一组细胞在发育早期发生突变时，就会发生体细胞镶嵌。随着这些细胞的迁移，它们组成的细胞群在遗传组成和临床表现上都不同于周围的细胞。其中最常见的可能是颜料镶嵌。其他例子包括表皮痣，地衣纹和变形杆菌综合征。最近发现负责Proteus综合征的体细胞镶嵌突变。从受疾病影响的组织和外观正常的组织中进行外显子组测序，仅在临床受影响的组织中发现了AKT1的激活突变。在雌性中，每个细胞中X染色体之一的散发失活会导致另一种形式的镶嵌：冻融。在某些X连锁疾病的皮肤中很容易观察到这种情况，例如色素失禁和局灶性皮肤发育不全。这些疾病在雄性中具有致命性，但雌性则通过赖氨酸化生存。在发育早期，雌性中的每个细胞使X染色体之一沉默。这些细胞群沿着布拉什科氏谱系迁移，在一个女婴中，有可能看到皮肤的哪些区域含有表达带有野生型等位基因的X染色体的细胞，以及哪些具有突变。
在研究镶嵌异常时，确定受影响的细胞系传统上是提出的第一个问题。经典地，成纤维细胞培养物是从皮肤活检中生长的，并且在这些细胞系上进行了DNA测序。如果花叶病主要影响角质形成细胞或脉管系统，则将不会引起突变。现在，在某些情况下，对在皮肤活检中获得的所有组织进行处理以提取DNA。只要目的细胞的DNA至少占总DNA的一定百分比，就可以检测到未受影响的皮肤或造血细胞的遗传变异。镶嵌疾病为遗传研究提供了极好的机会；内置控件位于患者未受影响的组织中。受影响和未受影响的组织之间的唯一区别应该是导致相关表型的遗传变异。确定疾病的遗传原因的第一步通常是尽可能多地巩固所述表型。一组具有表型变异的患者可能也会导致队列中的遗传差异也很小，这可能使发现潜在的遗传原因具有挑战性，甚至是不可能的。在尝试发现疾病的根本遗传原因时，决定使用哪种方法取决于几个因素。对于常见的遗传性复杂疾病，如牛皮癣或特应性皮炎，通常最适合进行GWAS或CNV研究。这些方法能够识别可能有助于一种表型的众多遗传变异。对于稀有疾病，使用外显子组或WGS可以更轻松地寻找具有重大影响的遗传变异。
随着肿瘤基因检测网接近每个遇到的患者，随着WGS时代的来临，将会出现许多道德问题。当肿瘤基因检测网寻找特定临床问题的答案时，肿瘤基因检测网如何处理所发现的附带信息？该信息的公开是否取决于它会改变对患者的预防或治疗策略？当从血液或组织样本中收集到的信息可能继续变化时，尤其是如果存储在生物库中时，肿瘤基因检测网如何获得知情同意？肿瘤基因检测网每天看到的患者的基因分析很快将变得司空见惯。使用NGS的新技术和方法也将非常丰富。同样重要的是，软件和数据库系统来分析通过增加使用NGS而获得的大量数据。对于皮肤科医生来说，重要的是要理解NGS的概念及其应用方式。当遇到临床问题时，重要的是要了解可用的基因检测的广度以及最适合回答当前问题的方法。 |
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