在过去30年中，PCR的发明和人类基因组的完成是两个科学的里程碑，开创了分子医学的新纪元，在这个新纪元中，基于基因的测量越来越多地诊断，分层和治疗疾病表达和序列。尽管取得了许多成功，但这种范例仍处于萌芽状态，其全部影响可能会在未来十年或更晚的时间内显现出来。推动这种临床护理发展的是不断发展的更加灵敏，精确和经济高效的核酸分析方法。由于测序能力的惊人进步，许多国际努力正在动手，以绘制出患者以及多种疾病状态的变异性和复杂性。如今，对每个人的基因组进行测序的前途奇妙的前景现在正接近成为实用，甚至具有成本效益的命题。似乎十年前已经宣告的基因组学的曙光现在终于来了。从现在开始的十年内，关注靶向药物的肿瘤基因检测网所有人都将被测序吗？也许。这是否将消除对诊所进行定向基因检测的需要？不太可能。
　　 尽管基因分型测试最终可能会被测序所取代，但疾病特异性体细胞突变和基因表达特征的迅速增加的库存将推动对基因测试的需求不断增长。在可预见的将来，只有一小部分生物标志物可能在临床上可行，这将对小型生物标志物的快速，经济高效和高性能的测量和监测给予重视。长期以来，实时定量PCR一直是此类应用的黄金标准，并且是临床筛查和诊断的基石。尽管qPCR具有简单，低成本，良好的灵敏度和高动态范围等优点，但它确实具有重要的局限性：它不能提供分子丰度的绝对定量；即使在最佳条件下，测量精度也被限制在大约20％；大量反应，有限的特异性和聚合酶错误共同导致假阳性，严重限制了实际可获得的灵敏度。这些特性使qPCR不适用于许多重要应用，包括小等位基因失衡的检测，精确的拷贝数分析以及高同源序列背景中稀有突变的检测。有没有更好的东西可以立即替代临床中的qPCR？包括小等位基因失衡的检测，精确的拷贝数分析以及高同源序列背景中稀有突变的检测。有没有更好的东西可以立即替代临床中的qPCR？包括小等位基因失衡的检测，精确的拷贝数分析以及高同源序列背景中稀有突变的检测。有没有更好的东西可以立即替代临床中的qPCR？
　　 关注靶向药物的肿瘤基因检测网相信，新开发的数字PCR技术现在提供了qPCR的高性能替代品，qPCR应该被用作核酸分子测试中的新标准。在该技术中，首先将样品以有限的稀释度分成多个反应，然后进行PCR扩增，然后进行终点检测，以针对每个反应生成“数字”信号，对应于是否存在起始模板分子。根据该数字模式，可以确定起始模板分子的绝对浓度，而无需与标准品进行比较。直到该方法在1999年改编为96孔和384孔格式后，它才开始流行。这是因为dPCR的能力主要取决于规模。dPCR测量的精度，特异性和动态范围与每次测量的反应总数有关。此外，减少反应体积可通过实现高有效模板浓度从根本上改善单分子检测，同时抑制非特异性扩增，这种特性在存在序列相似性高的背景时特别重要。此外，由于需要大量反应，因此小体积格式对于进行经济高效的分析至关重要。最后，dPCR本质上比qPCR更为健壮，仅需以高信噪比成功扩增即可，从而使其对检测设计和反应条件的敏感性降低。
　　 与qPCR相比，dPCR提供了绝对的定量，更高的鲁棒性，更高的精密度，相当或更高的动态范围以及更高的灵敏度和特异性。为什么近20年前首次报道的这种方法没有得到更广泛的应用？以前，采用的技术障碍很明显：稳健性；成本;复杂的工作流程；并且使用仪器的机会有限。但是，在过去的5年中，dPCR平台的开发和商业化取得了重大进展，这将大大增强这种高性能方法在研究和临床测试中的使用。如上所述，小型化是dPCR技术的中心主题，可用的解决方案基于并行微流格式或乳液分区，然后进行液滴的连续分析。用于dPCR分析的一类先进方法是基于油水乳状液中单分子的扩增。该策略是dPCR首次可扩展实施的基础，BEAMing，其中将单个分子与磁珠的分隔用于生成具有克隆扩增靶序列的珠库。然后使用序列特异性荧光探针标记这些颗粒，并通过流式细胞仪计数。目前，正在将BEAMing在分子诊断中的应用商业化。尽管进行了商业化努力并取得了一些临床成功，但是BEAMing的广泛采用仍然受到工作流程复杂性的阻碍。
　　 或者，已开发出使用微流体剪切流生成单分散乳液的方法，可用于高通量dPCR。在这种策略中，将单个分子分离成皮升体积的液滴，进行PCR扩增，然后使它们流过荧光检测器以进行“读取”。最近的两份报告已经使用这种方法实现了高性能dPCR，RainDanceTechnologies和BioRad将这些系统独立商业化。RainDanceThunderStorm平台预计将于2012年初启动，基于微流体格式，用于pL液滴的形成和读取。开发的最新发布的BioRad-QX100系统使用96孔板格式，每个样品分析20,000个1-nl液滴。此实现可能非常适合低成本和可变样本大小很重要的应用。最成熟的dPCR平台是FluidigmDigitalArray，它使用集成的微阀技术在微流控芯片上分配纳升体积反应的平面阵列。该系统的主要优点包括耐用性，极其简单的工作流程以及可以并行分析多个样品的简便性，使其非常适合于高通量应用和集中测试。该系统的当前版本允许对48个样品进行并行分析，每个样品有770个反应，每个样品的检测体积为850-pl。关注靶向药物的肿瘤基因检测网小组最近使用表面张力分配而不是机械阀来扩展此密度，以每次运行数百万个反应的规模执行基于芯片的dPCR，实现了440,000cm的反应密度和小至3pl的反应体积。这种“百万像素”格式保留了基于芯片的dPCR的简单性和工作流程优势，同时实现了与液滴格式报告的最佳性能相当或更好的性能；动态范围最高达10，单核苷酸变异检测低于每100,000个野生型序列1个拷贝，并且辨别出1％的染色体拷贝数差异。除了支持非常苛刻的诊断应用程序外，大型dPCR阵列还可拆分为许多样品，以进一步提高通量并降低成本。
　　 dPCR的其他基于芯片的新兴解决方案包括OpenArray和SlipChip。OpenArray平台最初由BioTrove开发用于qPCR应用，由307233-nl反应器组成，该反应器由使用疏水涂层固定液滴的微细“通孔”产生。在这种方法中，自动分配用于以大约36,000个反应的总通量装载反应器阵列，每次运行最多48个样品。描述了一种SlipChipdPCR装置，该装置使用两个微结构化底物的平移进行反应的分隔；将样品加载到由两个玻璃板上的匹配特征创建的注油通道中，然后将芯片“滑动”以隔离定义的体积。尽管每个设备的总反应数量不多，但是该系统使用多体积方法来保留良好的动态范围和灵敏度。无论采用何种技术，dPCR都可能成为分子诊断的基石。除了上述无与伦比的技术能力外，绝对数字量化还大大简化了原始结果的解释，并促进了更标准化的临床解释和跨患者人群的比较。尽管常规临床测试中尚未采用dPCR，但一些研究已经证明了这种方法在苛刻的诊断应用中的强大功能，包括罕见突变和小的等位基因失衡的检测。
　　 dPCR的第一个主要应用是检测癌症中的低水平突变。在一个实例中，BEAMing方法用于定量结直肠癌患者循环肿瘤DNA中患者和肿瘤的特异性突变。循环肿瘤DNA水平的数字测量优于癌胚抗原分析，可预测手术切除后的疾病复发。在另一项研究中，BEAMing扩展到了甲基化分析，并应用于大肠癌的早期检测和疾病监测，据报道其敏感性比仅用癌胚抗原高出约四倍。用于可扩展dPCR的最广泛使用的方法是Fluidigm平台。该平台的敏感性提高，可以检测和量化早期可切除的非小细胞肺癌肿瘤中存在的EGFR突变，并预言了此类突变的早期鉴定可能可以实现根治性的早期治疗。另一项研究比较了该平台与核苷酸测序和等位基因特异性寡核苷酸PCR在检测ABL酪氨酸激酶结构域突变中的性能。尽管三种情况下的比较方法在大多数情况下是一致的，但已证明dPCR能够比测序方法更早地进行检测。
　　 除了检测罕见的分子事件外，dPCR的精度还特别适合分析拷贝数变异和小的等位基因失衡。一项研究使用Fluidigm平台评估了ERBB2拷贝数变异，并显示dPCR测量与qPCR测量相对应，但技术变异性明显较低。在单独的应用中，dPCR被用作替代羊水和绒毛膜绒毛样品中胎儿核型分析的细胞遗传学分析的快速替代方法。dPCR也已用于准确定量母体血浆中循环的胎儿DNA的量，作为胎儿非整倍性的非侵入性诊断方法，对微妙的等位基因失衡的分析意义重大，该方法已被下一代测序验证。
　　 不管使用何种技术实施方式，所有这些研究都突出了dPCR在诊断中的巨大潜力，不仅可以改善现有测试的性能，而且还可以实现原本无法访问的新应用。尽管监管部门的批准可能会给临床使用留下最大的障碍，但是该过程已经开始，并且成熟的dPCR平台的可用性为该技术的广泛采用铺平了道路。随着新生物标记物的快速发展，dPCR将发现许多具有高影响力的应用，包括癌症的早期检测，化学疗法反应和残留疾病的监测，病原体的鉴定和定量，产前诊断和免疫学。不断的技术进步将扩大dPCR的普及性，其新应用包括从快速即时检测到可扩展的单细胞分析。考虑到过去几年中进步的步伐，这可能不会花很长时间。