全血DNA甲基化标记物 |
乳腺癌在2012年有170万例，死亡>500,000例，是全世界女性中最常被诊断出的癌症，也是导致癌症死亡的主要原因。乳房X线照相术是目前最广泛用于乳腺癌筛查的方法，证据表明，它可以降低50至69岁女性的乳腺癌死亡率。然而，对于40到49岁的女性，其获益尚不确定，并且假阳性结果和过度诊断的风险值得关注。鉴于使用某些非侵入性血液检查筛查特定癌症可以提高患者的依从性，并且已经显示出相对较好的诊断性能，因此对于早期非侵入性检查也可能有一种方法乳腺癌的检测风险分层。
表观遗传修饰，例如DNA甲基化，是可遗传的和可修饰的标记，具有调节基因表达而无需改变基础DNA序列的能力。先前对血浆和血清中DNA甲基化变化的研究表明，基因特异性位点的DNA甲基化可以为非侵入性乳腺癌筛查提供有希望的替代方法。此外，对全血的几项研究还表明，外周血细胞或白细胞DNA甲基化可潜在地预测乳腺癌。在本文中，肿瘤基因检测网系统地审查了乳腺癌和健康对照患者全血DNA中已发表的DNA甲基化研究，以概述用于乳腺癌风险评估早期检测的DNA甲基化标记物的性能。根据预定义的协议进行了系统的文献综述。报告遵循PRISMA声明。进行了系统的文献检索，以鉴定评估乳腺癌和健康对照患者全血DNA甲基化的研究。在PubMed和ISIWebofKnowledge中搜索了截至2018年5月29日发表的相关文章。使用以下关键字组合进行搜索：乳腺肿瘤或乳腺癌或乳腺恶性肿瘤或乳腺或乳癌的恶性肿瘤。
肿瘤基因检测网的评论中仅包含英文文章。初始屏幕是基于阅读标题和摘要完成的。肿瘤基因检测网排除了与以下主题无关的文章：与该主题不相关；非原创文章或评论；并非基于全血样本；着眼于全球DNA甲基化；不能作为全文提供版。第二轮筛选涉及阅读全文。也没有排除没有任何有关P值用于甲基化水平，OR，AUC或敏感性/特异性比较的相关信息的文章。此外，肿瘤基因检测网还从交叉引用中识别了许多论文。两位作者从满足上述纳入和排除标准的研究中独立读取和检索数据。研究人员之间讨论并解决了任何不一致之处。提取了以下变量：第一作者，发表年份，国家，研究设计，研究人群的年龄，DNA甲基化测定，目标遗传区域的信息和基本结果，包括病例与对照组之间甲基化水平差异的P值，OR，AUC，敏感性和特异性。如果未明确报告敏感性和特异性，则根据可用的表格和数字进行计算。还使用文章中提供的基本信息为研究计算了粗加工OR。
根据诊断准确性研究的质量评估评估了其中包含的文章的质量，并使用ReviewManager完成了QUADAS-2表。在四个方面评估了偏倚风险和适用性问题：患者选择，指标测试，参考标准以及流程和时机。在每个领域中，存在偏见风险以及与适用性有关的担忧，分为低，高或不清楚。最初的搜索使用上述搜索词生成了784条文章。删除230篇重复的文章后，仔细审查了554篇文章的标题和摘要，结果对34篇文章进行了全文审查。排除了8条，因为有关P的相关信息值，OR，AUC，敏感性或特异性无法提取。此外，通过交叉引用确定了七篇文章。最后，有33项研究符合纳入标准，并被纳入本评价。可以在25篇文章中提取或计算有关OR的信息。在其他八项研究中，仅报道了乳腺癌病例与对照组之间DNA甲基化水平差异的统计测试结果。可以在18项研究中提取灵敏度和特异性，而只有5项研究报告了AUC。
33个识别的研究，16人在欧洲来自德国，平均年龄或中位年龄。由于匹配，病例和对照之间的年龄分布基本可比，但是一些研究报道了主要的年龄差异和对照的年龄明显降低。各种技术用于测量甲基化，其中甲基化特异性聚合酶链反应是最常用的技术。基于阵列的测定法，诸如的InfiniumHumanMethylation27K或450KBeadChip芯片在八个研究施加。大多数研究确定的没有使用验证组，以确认他们的结果，而只有八个研究进行独立验证。
根据QUADAS，所有包含研究的总体偏倚风险和适用性评估报告。S2和S3。在33项研究中，有22项被判断为低风险，八项处于不清楚的风险中，三项被认为存在患者选择偏见的高风险。由于这些研究中使用的非甲基化方法，在33项研究中有14项被判断为对指标测试的进行或解释存在不明确的偏见。关于癌症诊断的参考标准，所有研究均被判定为低风险。最后，在33项研究中，有20项被认为对患者流量的偏倚风险尚不清楚。
所包括的33项研究中，25个研究应用基因特异性的方法和报告70个甲基化标记和八个研究使用基于阵列的技术，并报告了285个差异甲基化的CpG位点。其中285个CpG位点，九个CpG位点，包括C7orf50-cg03916490，GREB1-cg18584561，HYAL2-cg27091787，MGRN1-cg00736299，RPTOR-cg06418238，RAPSN-cg27466532，PNKD-cg01741999，TMC3-cg27639199和S100P-cg22266967从相同的研究独立样品中进一步证实。总结了这9个CpG位点以及70个基因特异性标记，并在补充表S2中列出了其他276个CpG位点。在79个标记中有20个被报告≥2次，而其余标记仅被报告了一次。评估BRCA1甲基化的频率最高，其次是CDH1和APC。报告≥2次的单个标记的统计显着性发现的频率范围为0％至100％，例如IGF2和RASSF1A报告两次和三次，分别与在各研究的不显着的结果，CXCL12和SFRP1均与在所有的显著结果报告两次研究报告了其他16种标记物，在研究相应标记物的部分研究中结果显着。与对照组相比，乳腺癌病例甲基化变化的方向。在评估≥2次的基因中，大多数病例中甲基化程度最高，只有PTGS2，RARB和SFRP1被低甲基化。在仅报告过一次的59种基因特异性甲基化标记中，有13种显示出统计学上显着的高甲基化，有13种显示了低甲基化，有33种与BC无关联。另一方面，在276个EWAS衍生的CpG位点中，有214个被低甲基化，而62个被高甲基化。列出了所有标记的目标遗传区域。与八项基于阵列的研究可以检测到整个基因组中广泛的CpG位点相比，绝大多数基因特异性研究评估了靶基因启动子区域的甲基化水平，只有极少数研究评估了基因体的甲基化水平或印迹差异甲基化区域。
18项研究中的11项估计了与乳腺癌相关的11种基因的二甲基化水平，这些基因是由四种类型的甲基化技术衍生的，包括MSP，甲基化敏感的高分辨率熔解，焦磷酸测序和甲基维。七个标志物与乳腺癌呈正相关，OR范围为1.08至5.00。BRCA2，CDH1，CLOCK和RARB与乳腺癌呈负相关，OR介于0.23至0.65之间。只有11项研究的4设置在回归模型调整协变量信息。17项研究的估计与乳腺癌用于通过四种类型的甲基化的技术，包括的Illumina450K，的MassARRAY，焦磷酸测序，和Methylight推导出的15个基因的定量甲基化水平的关联。OR值在四种形式估计，包括最低的一组与最高的五分之一，四分位数最低与最高四分位数，10％以下的甲基化，并进行甲基化M值。它们都集中在ATM的基因体上，并发现ATM甲基化与乳腺癌之间始终存在强的关联。进行的其他四项研究中，研究人员使用了测试验证方法，他们的发现均在他们自己的验证步骤中得到了证实。值得注意的是，MGRN1，RAPSN和RPTOR中三个CpG位点的甲基化不足研究在三个验证小组中显示出与乳腺癌风险有很强的联系，发现并验证了HYAL2和S100P中的脱甲基与BC的强关联。七项研究调整为协变量集有限的，包括年龄，家族史，研究队列，或测量批次，以及一项研究没有提供关于协变量调整信息。
全血DNA甲基化标记物的诊断性能概述所示。大多数标记物显示出非常有限的区分能力。七项研究评估BRCA1的性能，灵敏度从10％至43％在大约85％至95％的特异性。研究的HYAL2表现出最好的区分性：在两次验证中，特异性为90％时，灵敏度分别为58.50％和63.88％。其中一个验证样品的灵敏度为71.60％，特异性为76.60％，AUC为0.81，不幸的是，在另外两个验证集中，AUC为0.68和0.70。其他三个标记，包括DBC2，PTEN和P16INK4a，表现出相对适度的区分性，在≥75％的特异性下灵敏度>40％。
仅在五项研究中评估了各个甲基化标记的组合。标记物组似乎增强了诊断效力。例如，P14/ARF和P16/INK4a与乳腺癌二分类的个体关联的OR为1.99和2.14，两种标记物的存在与否和两种标记物的不存在的OR分别为12.31。但是，在唐及其同事的研究中未观察到结合多种标记物的改进性能：MGRN1，RAPSN和RPTOR组合的AUC在三组验证中分别为0.79，0.60和0.62。
在这份系统的文献综述中，肿瘤基因检测网确定了33项评估基于全血DNA甲基化标记物的研究对乳腺癌的潜在诊断价值。鉴定的研究使用10种类型的甲基化测定法研究了基因特异性标记物和基于甲基化阵列的标记物。在单变量或多变量回归分析中，只有少数标志物与乳腺癌有显着相关性，并且这些标志物的诊断效力相对中等，只有六个标志物灵敏度>40％，特异性>75％仅两个进行了独立验证。值得注意的是，所有标记的诊断性能，尤其是那些源自表观基因组关联研究的诊断性能，尚未在较大的独立样本中得到验证，因此需要谨慎解释。
与另一种表观遗传标记相比，在血清或血浆中检测到的miRNA具有潜在的乳腺癌诊断潜力，本研究中所综述的DNA甲基化标记的性能似乎不太乐观。如果将特异性阈值设置为≥90％，则仅一项HYAL2的敏感性报告>50％。迄今为止，已鉴定标记物的诊断能力相对较弱，可能主要来自先前研究中用于确定甲基化水平的实验方法。尽管DNA甲基化分析方法发生了革命性变化，但发展最快，绝大多数用于定性或半定量测定或定量的方法纳入研究只能分析特定基因的特定区域内的DNA甲基化。例如，除了这些方法对CpG的覆盖范围非常有限外，MSP一次只能评估一个或两个CpG。此外，通过测量本身或通过在统计分析中定义任意临界值对甲基化水平进行简单的二分法通常会导致大量信息丢失。即使基于微阵列或测序的高通量技术已经使用了约10年，只有六个纳入研究衍生使用表观基因组范围的分析候选标记。限制使用表观基因组范围分析的原因可能包括其较高的每样本成本，并且少数此类研究中的样本量限制可能在表观基因组范围分析中具有有限的功效，这些过程需要进行严格的调整才能进行广泛的多重检测校正。值得注意的是，到目前为止确定的最有前途的标记HYAL2是从Illumina27K分析而不是Illumina450K分析得出的。但是，不断发展的技术可以覆盖整个基因组中的CpG，例如IlluminaEPIC分析，为挖掘和衍生出新的甲基化标记物带来了新的机遇。在大规模财团以多种成功的方式结合来自多个研究的数据的情况下，与最成功地用于全基因组关联研究的方式类似，进一步的财团应利用新的分析方法来识别信息性甲基化标记物，以用于乳腺癌的诊断。
除了甲基化分析的可变性之外，纳入研究人群以及估计和报告与乳腺癌相关性的方法学的异质性也妨碍了直接比较研究对象甲基化标记。这些异质性也部分解释了评估相同甲基化标记物的研究的不一致或矛盾之处。例如，有来自六个西方七项研究，并从三个东方四项研究评价BRCA1甲基化。这些研究中的乳腺癌病例数在7到1021之间，年龄在26到89之间。在11项研究中使用了五种类型的甲基化测定法。的11项研究的是发现显著协会，两个研究仅报告P<0.05，用于测试病例和对照之间甲基化水平的差异，其他三个研究报告的OR中，只有一项研究报告了有关风险估计中混杂因素调整的信息。此外，乳腺癌是一种遗传和组织学上的异质性疾病，并且还确定了乳腺癌组织中亚型特异性甲基化谱。尽管大多数研究都纳入了所有类型的乳腺癌病例，但一些研究集中于特定的乳腺癌亚组，例如仅就地或浸润性乳腺癌，三阴性髓样乳腺癌或散发性乳腺癌仅乳腺癌。所包括研究的异质性使肿瘤基因检测网无法进行荟萃分析，以提供所研究标记物诊断性能的摘要估计。未来的研究应特别注意选择病例，在病例对照研究或嵌套在前瞻性队列中的病例对照研究中，对潜在的混杂因素进行仔细的匹配调整，定量甲基化测定，并通过复杂的统计方法分析数据，以鉴定与乳腺癌真正相关的甲基化标志物。
严格的独立验证对于获得可靠的遗传和表观遗传标志物或标记物至关重要，尤其是对于在全基因组方法中发现的候选物而言。仅在八项研究中，对独立样品进行了验证。甚至在2至3个独立样本中进行了验证。值得注意的是，S100P的性能相对较好。仅在一个验证样品中观察到了该值，而在其他两个验证样品中未观察到。这突出了在高质量研究中进行外部验证的必要性，最好是在疾病诊断之前预先收集了血样的研究中。值得注意的是，大多数纳入研究对已经诊断出乳腺癌的患者进行了甲基化标记物评估，从而甲基化水平的改变可能是由疾病过程导致的。血液采样的时机可能是MGRN1，RAPSN和RPTOR中三个CpG位点与唐氏及其同事的研究显示出与乳腺癌密切相关的原因之一巢式病例对照研究中显示为空关联，该研究在疾病出现之前采集的血液样本中检测了DNA甲基化。尽管由于乳腺癌表现而导致的甲基化变化或在乳腺癌表现后出现的甲基化变化对于乳腺癌的早期发现仍具有一定的价值，但对于可能用于乳腺癌发展风险分层的标记物，前瞻性验证是必不可少的。
与血清或血浆分析相比，这种分析包含有限数量的无细胞DNA，半衰期短且对加工具有较高的敏感性，基于全血样品的DNA甲基化分析具有多个优势，包括更易于接近和加工。作为血液DNA的充分性和稳定性。由于全血DNA呈现白细胞亚型的混合物，并且白细胞亚型之间的甲基化模式可能会有所不同，因此一直引起人们的主要关注，即衍生的甲基化标记可能至少部分反映了白细胞亚型的变化。但是，可以通过调整WBC计数或估计数据分析中的WBC分布来控制潜在的混淆效果。在这一领域已经广泛使用了非常完善的白细胞亚型估计。此外，即使血液DNA甲基化模式部分由白细胞分布驱动，也可能不会使甲基化标记物在乳腺癌诊断中的使用无效。
在过去的十年中，已经进行了许多努力来研究甲基化特征与乳腺癌之间的关系。尽管到目前为止，已建立的血液DNA甲基化标志物不足以早期检测乳腺癌，但其中一些可能具有潜在的乳腺癌危险分层。尽管如此，该领域仍处于新生阶段。除了担心出版偏倚外，以前的大量研究都是回顾性研究，甲基化标记物在疾病发作后进行测量，并且可能已受到疾病过程的影响。因此，先前关于异常DNA甲基化的报道需要在前瞻性，高质量研究中得到验证，并通过使用精确，定量的方法在大量筛选人群中进行测试。用于表观基因组范围的甲基化分析的先进新技术，当用于足够大的研究样品中时，应有助于鉴定真正相关的甲基化标记物或组以预测乳腺癌风险。此外，由于多种SNP的组合已显示出区分具有不同乳腺癌风险的妇女的能力，因此将基于甲基化的风险评分和多基因风险评分相结合可以提供更准确的风险预测，并有助于识别风险增加的女性，从而可能有助于将来增强个性化，适应风险的筛选策略。
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