多激酶抑制剂索拉非尼是晚期肝细胞癌的少数几种全身治疗选择之一，并通过阻断快速加速的纤维肉瘤和血管内皮生长因子信号发挥其抗增殖和血管生成作用，并有望取得更好的进展晚期肝细胞癌患者的生存率。索拉非尼还被证明可减弱HCC细胞的线粒体功能。但是，并非所有患者对索拉非尼都有反应。通过靶向代谢途径致敏HCC细胞索拉非尼治疗显示出是有前景的方法来开发的患者的新的治疗选项晚期HCC。Sirtuin1在55％的HCC患者中过表达，这与更高的肿瘤等级和较差的长期存活率有关。SIRT1可调节蛋白质为肿瘤发生重要的活性，因此，支持肿瘤的增殖和进展以及耐药性。SIRT1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰基酶。由于代谢改变，癌细胞对NAD的需求更高，作为细胞能量代谢反应中的氧化还原伴侣。NAD依赖性酶调节癌细胞生长所需的关键细胞过程，包括转录，细胞周期进程，抗凋亡和DNA修复。对于癌症细胞提供足够的NAD，许多肿瘤类型过度表达烟酰胺磷酸，哺乳动物NAD补救的关键酶。在以前的研究中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网可以证明通过其特异性抑制剂FK866抑制NAMPT活性会诱导能量应激，导致HCC细胞凋亡，这与单磷酸腺苷激活的蛋白激酶介导的机制相关雷帕霉素信号转导的靶标。根据关注靶向药物的肿瘤基因检测网的数据，并考虑到SIRT1可能在抗药性方面发挥作用，因为它具有使肿瘤抑制因子脱乙酰化的能力，目前的研究旨在找出索拉非尼是否会影响NAMPT/SIRT1/AMPK信号通路和能量代谢。关注靶向药物的肿瘤基因检测网假设抑制SIRT1支持肝癌细胞系中的凋亡。关注靶向药物的肿瘤基因检测网可以证明索拉非尼治疗HCC细胞会导致线粒体功能障碍，并降低NAD和三磷酸腺苷水平。这与AMPK的激活和随后的mTOR信号传导的抑制有关。SIRT1抑制不会使肝癌细胞系对索拉非尼敏感，而SIRT1过表达导致索拉非尼治疗后通过增加p53的脱乙酰作用来减少凋亡，因此可能是HCC细胞获得索拉非尼耐药性的潜在机制。
为了检查索拉非尼在本研究中所使用的肝癌细胞系中是否具有活性，将HUH7，Hep3B和HepG2细胞用浓度范围从0到10uM的索拉非尼进行了24小时刺激。分析了细胞外信号调节激酶，快速加速纤维肉瘤，细胞活力，凋亡和乳酸脱氢酶释放的下游目标的磷酸化。用5uM索拉非尼刺激后，ERK的磷酸化降低。索拉非尼降低了HUH7和Hep3B的细胞活力。在最大剂量为5uM索拉非尼的情况下，凋亡细胞数和LDH释放在Hep3B和HUH7细胞中显着增加。在HepG2细胞中观察到了相同的结果，表明索拉非尼具有活性并促进细胞死亡。
接下来，关注靶向药物的肿瘤基因检测网旨在确定索拉非尼治疗是否影响NAMPT/NAD/SIRT1途径。有趣的是，虽然NAMPT蛋白和酶活性未改变，但在用5uM索拉非尼刺激后，HUH7和Hep3B细胞系中的细胞内NAD水平均显着降低。尽管SIRT1蛋白的丰度在索拉非尼治疗的Hep3B细胞中稳定，但HUH7细胞与索拉非尼孵育后显示出SIRT1蛋白水平显着降低。Micro-RNA-34a是SIRT1蛋白丰度的一种候选调控因子，并且在HUH7细胞中根据索拉非尼剂量而被上调。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网选择了HUH7细胞来进一步检查sorafenib-SIRT1的相互作用。
接下来，关注靶向药物的肿瘤基因检测网询问索拉非尼治疗是否对线粒体功能和细胞ATP水平有影响。与1uM索拉非尼孵育24小时后，不同呼吸状态下通透性HUH7细胞中的线粒体耗氧量显着降低。索拉非尼处理过的细胞中的柠檬酸合酶活性也降低，表明线粒体质量降低。为了测试索拉非尼对线粒体是否具有直接作用，索拉非尼直接添加到线粒体制剂中。呼吸作用不同呼吸状态诱导期间测量。复杂的I连接的O2的比例在底物苹果酸和谷氨酸的氧化磷酸化过程中的消耗减少了，而在底物苹果酸和谷氨酸上的复合物I相关的泄漏呼吸增加了。这表明索拉非尼对复合物I有直接作用。用5uM索拉非尼刺激24小时后，ATP水平降至0.3±0.1倍。AMPK激活和随后的mTOR信号下调也反映了这种能量匮乏状态。这些结果在Hep3B细胞中得到了验证。5uM索拉非尼治疗后未检测到ATP水平。因此，发现AMPK被激活，并且mTOR信号被下调。这些数据表明索拉非尼通过直接干扰线粒体复合体I功能来干扰细胞能量代谢。
先前的一项研究表明，肝癌中SIRT1表达较高的患者对索拉非尼的反应较差。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网假设抑制SIRT1活性可以使HCC细胞对索拉非尼敏感。因此，Huh7细胞共刺激的FK866，一个特定的NAMPT抑制剂，这导致降低的NAD水平，因此，降低SIRT1活性。出乎意料的是，将10nMFK866与索拉非尼组合不会增加凋亡细胞数。与FK866和sorafenib共同刺激均未增加Hep3B细胞的凋亡细胞数。为了验证该结果，siRNA下调了SIRT1蛋白水平，并测量了细胞周期分布。索拉非尼增加了对照细胞的凋亡细胞数，但在SIRT1敲低的细胞中未检测到进一步的增加，表明SIRT1的下调不会增加索拉非尼诱导的细胞凋亡。在SIRT1敲低细胞和对照细胞之间没有发现细胞周期分布的其他差异。
反之亦然，SIRT1蛋白过表达，或通过NAMPT酶产物烟酰胺单核苷酸将NAD水平标准化。SIRT1过表达和补充NMN均可减少索拉非尼诱导的HUH7细胞凋亡。SIRT1过表达比NMN补充具有显着更大的抗凋亡作用。NMN治疗导致索拉非尼治疗后NAD水平正常化和AMPK磷酸化降低。但是，mTOR和ERK信号既不受NMN处理的影响，也不受SIRT1过表达。同样，SIRT1的过表达既不能抵消索拉非尼诱导的线粒体功能障碍，也不会影响叉头盒o介导的抗氧化酶锰超氧化物歧化酶或过氧化氢酶的表达。但是，SIRT1过表达抵消了聚合酶1的裂解，表明具有抗凋亡作用。与此相一致，在SIRT1过表达的细胞中p53的脱乙酰基增加而总p53水平降低。促凋亡因子p53上调的细胞凋亡调节剂的表达受p53调节，并且发现与载体转染的细胞相比，索拉非尼治疗的SIRT1过表达细胞中的表达略有降低。因此，p53-PUMA途径可能与SIRT1诱导的抗凋亡作用有关。
晚期肝癌的少数全身治疗选择之一是多激酶抑制剂索拉非尼，但是，它并不能在所有患者中获得成功的治疗。原因之一可能是NAD依赖性脱乙酰基酶SIRT1的异常表达，它调节癌症的耐药性。研究表明，SIRT1过表达的HCC对索拉非尼的耐药性更高，生长更迅速，与非SIRT1过表达的肿瘤患者相比，这些肿瘤的预后较差。基于这些发现，关注靶向药物的肿瘤基因检测网询问SIRT1蛋白的修饰或活性是否可以改变HCC细胞系中肿瘤细胞对索拉非尼的反应。索拉非尼靶向肿瘤发展和进展中的几个主要过程。具体而言，索拉非尼能够抑制VEGF信号通路的酪氨酸激酶，从而减少肿瘤血管生成和RAF激酶，与抑制MAPK/ERK通路相关，从而导致细胞增殖减少。这与关注靶向药物的肿瘤基因检测网的研究一致，表明关注靶向药物的肿瘤基因检测网使用的所有细胞系均对索拉非尼治疗产生凋亡反应。其他研究显示，索拉非尼诱导的细胞凋亡通过Bax的线粒体易位和释放细胞色素C内在通路。这与关注靶向药物的肿瘤基因检测网的结果一致，表明索拉非尼诱导线粒体功能障碍和细胞ATP水平降低。
SIRT1使蛋白质脱乙酰基并调节其转录或活性，从而影响细胞能量代谢以及应激反应途径。SIRT1的活性取决于NAD的水平，因此取决于NAMPT对NAD的挽救。有趣的是，虽然索拉非尼孵育不会改变NAMPT蛋白的丰度和活性，但在关注靶向药物的肿瘤基因检测网的研究中使用的HCC细胞系中NAD的水平却显着下调。关注靶向药物的肿瘤基因检测网没有发现证据表明使用索拉非尼孵育后，NAD消耗酶聚聚合酶1和SIRT1的活性均增加，但在Hep3B中没有改变，而在HUH7中有所降低，可能是通过p53依赖性的微RNA-34A上调。有趣的是，与索拉非尼一起孵育后，关注靶向药物的肿瘤基因检测网显示了HUH7细胞中microRNA-34a的增加。在肝癌大鼠中，索拉非尼治疗肺转移后，rno-miR-34a-5p上调、。此外，微小RNA-34a已显示使肝癌细胞对索拉非尼治疗敏感、。因此，索拉非尼对microRNA-34a的上调可能是HUH7细胞中SIRT1下调的可能的潜在机制。
关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现与诱导线粒体氧消耗的降低，这已在心肌细胞和肝癌细胞已经描述索拉非尼是保温。与另一项研究相反，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现索拉非尼可直接抑制复合物I活性，而索拉非尼处理的细胞中柠檬酸合酶活性较低则可检测线粒体质量的降低。与诱导线粒体功能障碍一致，索拉非尼降低了肝癌细胞中的ATP水平，并激活了细胞能量传感器AMPK。与原代人肝细胞相比，AMPK在肝癌细胞系中的磷酸化程度较低，因此活性较低。活性AMPK抑制mTOR及其下游靶标p70S6K和4EBP1的磷酸化，它们分别是细胞增殖和蛋白质生物合成的重要调节剂。这与另一项研究相反，该研究表明索拉非尼不影响AMPK激活或ATP水平，这可以通过使用低得多的剂量的索拉非尼来解释。有趣的是，视黄酸激活的AMPK使HepG2细胞对索拉非尼治疗敏感。
以前的研究表明，HCC患者组织中高SIRT1水平与更坏的结果和索拉非尼的阻力增加相关。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网询问SIRT1的下调是否会使HCC细胞对索拉非尼敏感。FK866是一种特异性NAMPT抑制剂，可降低与较低SIRT1活性相关的NAD水平，并诱导HCC细胞系凋亡。FK866与依托泊苷的组合可通过乙酰化和随后p53的积累使白血病细胞系对依托泊苷治疗敏感。然而，在关注靶向药物的肿瘤基因检测网的细胞模型中，共同刺激FK866和索拉非尼并没有增加凋亡细胞数。同样，SIRT1蛋白的下调也不会导致凋亡增加。这可以通过以下事实来解释：索拉非尼治疗已经降低了关注靶向药物的肿瘤基因检测网模型中的NAD水平和SIRT1蛋白丰度，而SIRT1蛋白的额外下调或活性均无效。
有趣的是，通过过量表达增加SIRT1蛋白丰度或通过补充NAMPT的酶产物NMN增强SIRT1活性，可以抵消索拉非尼诱导的HUH7细胞凋亡。这与上面提到的人类研究一致。此外，NMN和索拉非尼的共同治疗可将NAD水平和AMPK磷酸化归一化，而mTOR信号传导或ERK磷酸化则不受影响。大鼠肉瘤/ERK和磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3激酶/mTOR途径是控制细胞存活和增殖的两个主要信号传导途径，它们不是并行运行，而是相互交叉调控-抑制或激活。由于mTOR是RAS/ERK途径的关键信号接收者，因此RAS-ERK途径而不是AMPK可能控制关注靶向药物的肿瘤基因检测网细胞系统中的mTOR活性。同样，SIRT1的过表达并不能改善线粒体功能，这与索拉非尼对复合物I的直接作用是一致的。潜在地，细胞可以通过增加糖酵解来适应复合物I的抑制作用，如SIRT1过表达的细胞所述和AMPK磷酸化增加，这与关注靶向药物的肿瘤基因检测网的结果一致。糖酵解通量的标准化也可以解释通过NMN观察到的NAD补充的抗凋亡作用。
p53被称为肿瘤抑制蛋白，在许多癌症类型中都会发生突变。由脱乙酰SIRT1抑制p53活性，伴随着增加的增殖和抗细胞凋亡作用。SIRT1调节p53转录依赖性细胞凋亡，这要求表达与细胞凋亡相关的靶基因，包括BAX，p53上调剂和NOXA。关注靶向药物的肿瘤基因检测网观察到索拉非尼诱导的PUMA上调，但未观察到BAX或BCL上调。但是，SIRT1还可以调节非依赖于p53转录的细胞凋亡，这将导致细胞色素c从线粒体中释放出来。这是通过增加的氧化应激介导的，由索拉非尼诱导的条件。
细胞系获自德国不伦瑞克的莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心。在MEM培养基中培养HepG2细胞和Hep3B细胞。HUH7细胞在高葡萄糖的DMEM培养基中生长。所有培养基均补充有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺。所有电池均在95％空气和5％CO2的湿润气氛中保持在37°C。为了进行实验，将细胞接种在合适的细胞培养板中并生长24小时。之后，将细胞在不含10％FBS的无血清培养基中饥饿过夜。用索拉非尼，烟酰胺单核苷酸，FK866和溶剂对照刺激细胞24小时或如下所述。将FK866和索拉非尼溶于DMSO。将NNN溶解在适当的介质中。转染前一天将HUH7细胞1：3分裂。使用NEON转染系统，用pECE-Flag-SIRT1或空载体转染细胞。第二天，将培养基换成SFM，将细胞饥饿过夜。如上所述，刺激细胞。通过使用细胞增殖试剂WST-1测量细胞活力。如前所述，FITCAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒适用于确定凋亡细胞。作为阳性对照，用棕榈酸酯刺激细胞24小时。使用LDH细胞毒性测定试剂盒测量LDH释放，并通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定根据制造商的方案测量ATP水平。24小时后收集贴壁细胞和漂浮细胞。沉淀后，将细胞在70％乙醇中固定过夜，然后与RNAse和碘化丙啶孵育，最后通过流式细胞仪进行测量。
如前所述在改良的RIPA缓冲液中裂解细胞]在24小时后用指定物质刺激后。使用PierceBCA蛋白质测定法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离出三十微克蛋白质，然后印迹到硝酸纤维素膜上。将膜在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中的5％脱脂奶粉中封闭，并与以下抗体一起孵育：抗磷酸-ERK，抗ERK，抗磷酸-AMPKα，抗-AMPKα，抗-phosphor-mTOR，anti-mTOR，anti-phospho-4E-BP1，anti-4EBP1，anti-phospho-p70S6K，anti-S6K，anti-phospho-FOXO1，抗-SOD2，抗过氧化氢酶，抗PARP，抗乙酰基p53，抗p53，抗PUMA，抗SIRT1，抗αTUBULIN，抗Visfatin，并按照制造商的说明使用抗GAPDH。使用LuminataClassicoWesternHRP底物或AmershamECLPrimeWesternBlotting检测试剂进行蛋白质的检测。
测量NAMPT酶活性。简而言之，将细胞与指示的物质一起孵育，收获并在pH7.4的磷酸钠缓冲液中溶解。加入含有TRIS，ATP，PRPP，MgCl和放射性标记的14C-烟酰胺的反应缓冲液后，将混合物转移至丙酮预浸泡的玻璃微纤维过滤器中。14C-标记的烟酰胺被转化为14C-NMN。14C-NMN的放射性在液体闪烁计数器中以每分钟计数的数量进行定量。通过反相HPLC测量NAD水平。用所示物质刺激24小时后，将细胞在1M高氯酸中溶解，并用3MK2CO离心后，将上清液使用梯度HPLC法和UV检测器装载到HPLC系统中。总RNA通过RNeasyMiniKit提取。根据制造商的协议。通过M-MLV逆转录酶将1微克总RNA转录为cDNA。随后，Taqman或SybrGreen分别使用qPCRMasterMixPlusLowROX或2XTakyon进行SYBRAssay-ROX分析，以及AppliedBiosystems7500实时PCR系统进行了分析。使用miScriptIIRT进行反转录后，使用miScript引物分析定量miR34a-1和Hs_RNU6_2_1的micro-RNA-34a，以便使用miScriptSYBRGreenPCR试剂盒进行标准化。
线粒体的氧消耗的测量根据。简而言之，用洋地黄皂苷。或者，如下所述分离线粒体。将样品添加到Mir05缓冲液的Mir05缓冲液中的Oxygraph2K室中。必需的无脂肪酸BSA，20mMHepes，在30°C下的pH7.1和37°C的线粒体复合物I，ADP，琥珀酸作为底物电子传输链复合物II的底物，依次添加解偶联剂FCCP和复合物I和复合物III的抑制剂，以确定归一化的O2流量至细胞数或O2在不同呼吸状态下，将通量标准化为线粒体蛋白量。在复杂I底物和ADP之后添加细胞色素c后，通过测量O2通量来评估线粒体膜的完整性。
线粒体是从大约70到80×10分离的细胞通过差速离心。用胰蛋白酶消化细胞并重悬于线粒体分离缓冲液。将细胞悬液转移至预冷的玻璃/聚四氟乙烯，以1000rpm的速度进行30次冲程匀浆，并在4°C下于600×g的预冷却2mL管中离心10分钟。将上清液转移至新管后，将细胞裂解液在3000×g的条件下离心10分钟在4°C下进行分钟。在7000×g离心下重复进行在4°C下放置10分钟。线粒体沉淀物用5mL新鲜缓冲液洗涤，然后在4℃下以7000xg离心10分钟。丢弃上清液后，将沉淀物重悬于小体积的缓冲液中，并使用Bio-RadDC蛋白质测定法确定蛋白质浓度。对于呼吸实验，使用300至500ug蛋白质/腔室。将索拉非尼或DMSO直接添加到每个腔室中，并如上所述测量呼吸。
根据比色法使用比色法通过测定5,5'-二硫代-双-的转化率来确定柠檬酸合酶活性。简而言之，用胰蛋白酶消化与1uMSorafenib或DMSO0.1％孵育24h的细胞，重悬于柠檬酸合酶样品缓冲液中，并通过冻融干燥4x裂解15,000×g离心后在4°C下10分钟，上清液用于蛋白质测定。将二十微克蛋白质添加到200uL反应混合物中，在30°C下测量412nm的空白吸光度15分钟。通过加入草酰乙酸酯开始反应，并继续测量15分钟。柠檬酸盐合酶活性是通过减去空白值和对DMSO对照的标准化来确定的，该值设置为1。统计分析使用GraphPad进行的Windows棱镜。使用单向方差分析，然后进行Bonferroni事后检验或不成对的Studentt检验来检验显着性。数据显示为平均值±SEM。统计学显着性设定为p<0.05。关注靶向药物的肿瘤基因检测网得出的结论是，索拉非尼靶向多种途径，包括能量代谢和蛋白丰度和NAD水平升高可能是促进肝癌患者对索拉非尼耐药的潜在机制。
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