CD24通过激活自噬在肝细胞癌中调节索拉非尼耐药 |
肝细胞癌是世界上最常见的原发性肝癌类型。与任何其他癌症一样，HCC的治疗和预后取决于肿瘤病理学，大小和患者的整体健康状况。大多数肝癌患者在确诊晚期，因而存在对于晚期肝癌新疗法的迫切需要。索拉非尼，几个酪氨酸蛋白激酶的小抑制剂，已被证明是有效治疗晚期HCC。索拉非尼的作用包括阻断Raf-MEK-ERK信号通路，以抑制肿瘤细胞增殖，并靶向血管内皮生长因子受体和血小板衍生生长因子受体来预防血管生成。尽管这样令人鼓舞的进展，索拉非尼耐药性仍然是一个严重问题，因为肝癌患者的总生存期后索拉非尼治疗只有2-3个月的时间比安慰剂。有在肝细胞癌索拉非尼阻力主要有三大原因：首先，血管内皮生长因子受体及其下游信号通路的异常变化;第二，沉默信息调节剂1诱导的索拉非尼耐药性过表达；第三，自噬的激活，可增强索拉非尼在肝细胞癌中的耐药性。但是，仍有许多其他机制可能会导致索拉非尼耐药。在这项研究中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网阐明了一种新的抵抗机制。
CD24是在大多数B淋巴细胞和几种肿瘤类型锚定，并有助于广泛的下游信号网络。CD24的耗竭导致体外细胞增殖，迁移和侵袭的明显减少。在关注靶向药物的肿瘤基因检测网的研究中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网证实与邻近组织相比，CD24在HCC肿瘤组织中高表达。有趣的是，与未治疗的患者相比，索拉非尼治疗后的残余化学耐药性患者中CD24的表达显着增加，这表明CD24参与了索拉非尼诱导的耐药过程。但是，尚无关于CD24在索拉非尼耐药中的作用的报道。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网研究了肝细胞癌中CD24与索拉非尼耐药之间的关系。通过临床采样，关注靶向药物的肿瘤基因检测网还发现患者体内CD24的过度表达伴随着自噬的激活。自噬允许细胞成分的降解有序和回收。自噬在癌症中的作用是近年来受到高度研究的一种。越来越多的证据表明，自噬的同时作为肿瘤抑制和肿瘤细胞因子的作用。在最近的研究中，一些文章报道，热休克因子蛋白1和活性氧介导的自噬激活可促进肿瘤细胞的耐药性。然而，CD24过表达如何诱导自噬以及自噬活化是否有助于肿瘤细胞耐药或是耐药机制均不确定。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网假设CD24通过激活HCC中的自噬来调节索拉非尼耐药性。
磷脂酰肌醇3-激酶/AKT/哺乳动物雷帕霉素途径的目标是自噬的关键调节。通过全转录组shot弹枪测序研究，关注靶向药物的肿瘤基因检测网确定了索拉非尼耐药细胞中mTOR/AKT通路下调的片段。此外，该途径在索拉非尼耐药细胞中存在剂量依赖性缺陷，并通过CD24敲除得以挽救，表明CD24通过抑制mTOR/AKT途径诱导自噬激活。MTOR主要由mTOR复合物1和mTOR复合物2组成，它们的亚细胞定位和结合伴侣不同。而mTORC1的调节自噬直接自噬相关基因13的活化的磷酸化/去磷酸化并通过4EBP1和p70S6K的调节翻译，mTORC2的在Ser473上激活AKT通过磷酸。这项研究表明，在抑制CD24的细胞中，蛋白磷酸酶2显着增加。因此，PP2A可能在CD24介导的自噬激活中起重要作用。因此，在这项研究中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网试图确定CD24，自噬和索拉非尼耐药之间的关系。针对这种关系，关注靶向药物的肿瘤基因检测网假设这是一种新型的耐药性机制，可能对肝癌的治疗具有治疗意义。
为了确定CD24是否标记耐索拉非尼的HCC细胞，关注靶向药物的肿瘤基因检测网通过qRT-PCR检查了其在HCC患者的肿瘤和相应邻近组织中的表达。首先，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现肿瘤组织中CD24的表达高于邻近组织。此外，与非索拉非尼耐药组织相比，经临床诊断的索拉非尼耐药肿瘤组织表达的CD24水平更高。接下来，关注靶向药物的肿瘤基因检测网检测了索拉非尼耐药相关蛋白ATP结合盒亚家族G成员2的转录。关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现，HCC患者的肿瘤细胞具有比邻近正常肝组织高得多的ABCG2，而耐索拉非尼的HCC患者的细胞表达最高的ABCG2。通过Western印迹和IHC染色验证了CD24的蛋白表达，结果表明CD24在人HCC组织中高表达，尤其是在肿瘤细胞中，索拉非尼耐药细胞表达的CD24水平明显更高。此外，生存分析表明，肝癌中高CD24表达的患者的预后明显低于低CD24表达的患者。
为了进一步研究CD24相关的索拉非尼耐药性的生物学效应以及分子机制，关注靶向药物的肿瘤基因检测网通过长期暴露于低剂量的索拉非尼建立了两种HCC细胞系。浓度为10uM的索拉非尼浓度。关注靶向药物的肿瘤基因检测网获得了Huh7和Hep3B索拉非尼耐药细胞。关注靶向药物的肿瘤基因检测网通过CCK8分析测量了索拉非尼的敏感性，结果表明耐索拉非尼的细胞具有较低的索拉非尼敏感性。通过westernblot分析，耐药相关蛋白在索拉非尼耐药细胞中高表达。此外，与野生型细胞相比，在存在索拉非尼的情况下，耐药的索拉非尼细胞表现出更高的细胞增殖和更低的凋亡。这些结果表明关注靶向药物的肿瘤基因检测网成功建立了耐索拉非尼的HCC细胞系模型。关注靶向药物的肿瘤基因检测网进一步在索拉非尼耐药细胞中检测到CD24表达。通过使用qRT-PCR，流式细胞术和Western印迹，在索拉非尼耐药细胞中检测到CD24显着增加。另外，索拉非尼的存在以剂量依赖的方式影响索拉非尼耐药细胞中CD24的表达。因此，在存在索拉非尼的情况下，CD24在具有较高细胞增殖和较低凋亡的索拉非尼耐药细胞中过表达。
为了更好地了解CD24是否对索拉非尼耐药是必需的，关注靶向药物的肿瘤基因检测网在Huh7/SR和Hep3B/SR细胞中用小的发夹RNA敲除了CD24。通过蛋白质印迹和qRT-PCR验证了组合效率。关注靶向药物的肿瘤基因检测网调查了几种恶性肿瘤相关因素。首先，在不同浓度的索拉非尼处理后48小时，通过CCK8分析检测细胞活力，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现CD24的下调可降低Huh7/SR和Hep3B/SR细胞的细胞活力，尤其是在索拉非尼超过1.5uM。此外，Huh7/SR和Hep3B/SR中CD24的敲低会显着降低其恶性行为，包括增殖和索拉非尼的治疗具有抗凋亡能力。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网得出结论，CD24与索拉非尼耐药有关。但是，潜在的分子机制应进一步探索。
为了了解CD24诱导的索拉非尼耐药机制，关注靶向药物的肿瘤基因检测网进行了全转录组shot弹枪测序，以确定Huh7/SR和Huh7/SRshCD24之间持续的细胞转录组变化。在所有转录本的无监督聚类分析中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网检测到两组样本的表达特征存在显着差异。主成分分析显示，当分析mRNA时，来自两组的样品显示出形成单独簇的趋势。使用差异表达的mRNA作为输入，关注靶向药物的肿瘤基因检测网使用《京都基因与基因组百科全书》，BioCarta和ReactomePathwayDatabase平台分析了与它们相关的重要途径。关注靶向药物的肿瘤基因检测网确定了许多丰富的途径，其中AKT/mTOR和自噬途径最为重要，但在其他地方进行了进一步研究。
为了确认RNA-Seq的预测，关注靶向药物的肿瘤基因检测网检测了索拉非尼对AKT/mTOR信号的激活。关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现，在Huh7/SR细胞中，Thr308中的AKT以及p-mTOR的磷酸化显着降低，但在Huh7/SRshCD24细胞中没有差异。在Hep3B/SR细胞中发现了相同的结果。这些结果可能表明CD24通过抑制AKT/mTOR信号传导的激活来调节索拉非尼耐药性。关注靶向药物的肿瘤基因检测网还发现，通过RNA-seq数据，AKT的一种抑制剂PP2A显着增加，关注靶向药物的肿瘤基因检测网进一步证实了其转录和蛋白质表达。关注靶向药物的肿瘤基因检测网推测CD24通过PP2A诱导的AKT/mTOR抑制与索拉非尼耐药相关。关注靶向药物的肿瘤基因检测网研究了PP2A抑制剂冈田酸和AKT激动剂SC79处理后细胞活力的变化。在不使用索拉非尼处理的情况下，细胞活力无明显变化，但在Huh7/SR和Hep3B/SR中，当抑制PP2A或增强AKT活性时，细胞活力均显着下降。关注靶向药物的肿瘤基因检测网用上述治疗方法进一步分析了AKT/mTOR的激活。关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现降低的细胞生存力与索拉非尼的治疗与AKT/mTOR信号的激活有关。由于RNA-Seq数据也表明自噬存在显着差异，并且自噬是AKT/mTOR信号传导的下游效应之一，因此关注靶向药物的肿瘤基因检测网继续探索自噬在CD24介导的索拉非尼耐药中的作用。基于此假设，关注靶向药物的肿瘤基因检测网通过使用IHC染色研究了人类临床样品中的此类信号传导，发现与索拉非尼敏感的组织相比，耐索拉非尼的HCC组织显示出AKT/mTOR的活化明显更低，但PP2A和LC3的表达增加-II。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网专注于CD24介导的自噬在索拉非尼耐药中的作用。
关注靶向药物的肿瘤基因检测网首先检查了Huh7/SR细胞和Huh7/SRCD24shRNA中自噬的水平。关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现，与1.5uM索拉非尼治疗的Huh7/SRCD24shRNA相比，Huh7/SR细胞中的LC3-II增加但p62减少。透射电子显微镜显示，Huh7/SR细胞中存在大量的自噬小体形态特征的双膜液泡结构，而Huh7/SRCD24shRNA细胞中却不存在。通过使用RFP-GFP标签的LC3，设计了一种荧光检测方法来监测自噬体。GFP信号对酸性和蛋白水解条件敏感，而RFP更稳定。融合信号表示隔室尚未与溶酶体融合。使用该标准，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现与Huh7/SRshCD24细胞相比，Huh7/SR细胞具有更强的自噬能力。要研究自噬对于CD24诱导的索拉非尼耐药进展是否必要，关注靶向药物的肿瘤基因检测网用1nMbafiIomycinA1处理了Huh7/SR细胞，该细菌通过阻断自噬泡-溶酶体融合来抑制自噬。尽管CD24没有明显变化，但Huh7/SR细胞的自噬被显着抑制，与未经BafA1处理的细胞相比，对索拉非尼的敏感性增加。关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现这种索拉非尼敏感性是由于细胞凋亡增加。还通过敲低ATG5来阻止自噬，ATG5是自噬囊泡中吞噬膜延伸的关键蛋白，并且通过Western印迹和透射电子显微镜观察，Huh7/SRshATG5细胞中的自噬被显着阻断。类似于BafA1处理，索拉非尼的敏感性在Huh7/SRshATG5细胞中显着增加。因此，关注靶向药物的肿瘤基因检测网在这里得出结论，自噬在CD24相关的索拉非尼耐药中起着至关重要的作用。
分别将5×10Huh7/WT和Huh7/SR细胞分别注入小鼠的左，右侧。一旦肿瘤达到尺寸的≥200毫米3时，将小鼠用100mg/kg的索拉非尼通过注射每周一次在无菌PBS中稀释处理。3周后，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现Huh7/SR来源的肿瘤生长快于Huh7/WT肿瘤。关注靶向药物的肿瘤基因检测网通过Western印迹发现肿瘤组织中CD24的表达增加，表明CD24可能与索拉非尼的体内耐药性相关。为了进一步研究CD24诱导的索拉非尼耐药性与自噬之间的关系，关注靶向药物的肿瘤基因检测网使用Huh7/SR和Huh7/SRshCD24细胞进行了体内肿瘤发生。3周后，用索拉非尼和BafA1治疗肿瘤，并在治疗过程中监测肿瘤体积。关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现索拉非尼抑制了来自Huh7/SRshCD24的肿瘤生长，但对Huh7/SR肿瘤仅具有轻微影响。但是，当索拉非尼治疗与自噬抑制剂BafA1联合使用时，Huh7/SR的肿瘤生长受到了显着抑制。该结果表明CD24依赖性索拉非尼抗性主要由体内自噬激活决定。最后，关注靶向药物的肿瘤基因检测网通过IHC染色检测了肿瘤组织中CD24，p-AKT，p-mTOR，PP2A-α和切割的LC3的蛋白表达，结果表明CD24shRNA的治疗可以通过阻断CD24诱导的自噬通过降低PP2Aalpha的表达激活AKT/mTOR信号。BafA1的处理对AKT/mTOR的表达和激活或自噬没有影响。
CD24是糖基-锚定的膜蛋白，其功能作为用于P-selectin和L1的粘附分子和造血过程中在细胞的选择和成熟中起作用，B细胞发育，神经发生。最近，研究已经在许多类型的肿瘤发生和进展的牵连CD24表达。然而，在不同的肿瘤或改变肿瘤的发病率环境中，存在CD24及其下游信号的不同活化的各种效果。最近，基于转录谱分析的研究表明，CD24在肝癌中高表达，可能是预测肝癌预后的良好生物标志物。关注靶向药物的肿瘤基因检测网研究所的成绩单分析也得出了这一结论。迄今为止，尚未报道CD24在肝癌中的预后意义的系统研究，尤其是在长期研究或大量随访患者中。此外，CD24在肝癌进展中的作用尚未明确。在关注靶向药物的肿瘤基因检测网的研究中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现与邻近组织相比，CD24在HCC肿瘤组织中高表达。值得注意的是，与未治疗的患者相比，索拉非尼治疗后残留的化学耐药患者中CD24的表达显着增加。一些文章报道了CD24介导的Met级联扩增可能有助于子宫内膜癌的耐药性。在体外，关注靶向药物的肿瘤基因检测网以剂量依赖的方式检测到CD24与索拉非尼耐药之间存在正相关。目前，索拉非尼已被用作晚期HCC的一线系统治疗。然而，索拉非尼介导的肿瘤致死性的直接机制仍有待充分表征，尤其是在HCC中。
这项研究首先证明了CD24与肝癌中索拉非尼耐药的关系。以前的研究已经表明，CD24大多与药物抗性作为癌症干细胞标记物分子相关。为了研究体外CD24与索拉非尼耐药之间的关系，关注靶向药物的肿瘤基因检测网成功建立了索拉非尼耐药HCC细胞系模型。与WT细胞相比，在存在索拉非尼的情况下，耐索拉非尼的细胞表现出较高水平的细胞增殖，侵袭和较低的凋亡。在此模型中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网已经确认CD24在索拉非尼耐药细胞中过表达。为了探索CD24在索拉非尼耐药中的重要作用，关注靶向药物的肿瘤基因检测网在索拉非尼耐药细胞中用小的发夹RNA敲低了CD24。关注靶向药物的肿瘤基因检测网观察到索拉非尼敏感性水平与Huh7/SR相比有所增加。因此，CD24的过表达导致索拉非尼在肝癌中的耐药性进展。
根据转录组shot弹枪测序的分析，关注靶向药物的肿瘤基因检测网集中于以下注释途径，包括AKT/mTOR信号传导途径和自噬途径。许多研究已经清楚地表明，自噬是一个细胞保护机制介导的耐药性。在关注靶向药物的肿瘤基因检测网目前的研究中，关注靶向药物的肿瘤基因检测网证实了患者肝癌样本中的自噬水平很高。索拉非尼耐药细胞中的索拉非尼治疗诱导了自噬的形态和生化特征，例如自噬体的产生，RFP-GFP-LC3的重新分布和LC3-II的积累。LC3被广泛用作隔离膜和自噬小体显微镜检测的标记物。此外，可以通过免疫印迹分析分别检测PE共轭LC3和非共轭LC3，并且LC3-II的量也广泛用于定量自噬活性。已经建议在隔离膜的关闭该LC3功能。CD24依赖性索拉非尼耐药性的影响在使用药理抑制剂或必需的自噬基因敲低自噬过程中消失或减弱。因此，CD24通过自噬激活来调节索拉非尼耐药性。AKT/mTOR途径是自噬激活的重要上游信号。然而，该途径在索拉非尼耐药细胞中以剂量依赖性方式存在缺陷，并通过CD24敲除得以挽救，这表明CD24诱导的自噬激活是通过抑制AKT/mTOR途径实现的。低氧微环境可以诱导CD24过表达。缺氧诱导因子可以结合CD24的启动子，从而促进胃癌细胞的浸润和转移。有两个CD24启动子序列，第一个来自人类DNA的混合样品，第二个来自B淋巴细胞。因子可能与CD24的启动子结合并募集PP2A，后者驱动CD24启动子激活并在索拉非尼耐药中表达。从RNA-Seq研究中可以看出，Huh7/SR细胞中的蛋白质PP2A显着增加。
总之，关注靶向药物的肿瘤基因检测网发现CD24在耐索拉非尼的肝细胞癌肿瘤细胞中高度表达。发现CD24是通过AKT/mTOR介导的自噬调节索拉非尼耐药所必需的功能标记。CD24表达水平也与肝癌的进展和预后有关。所有这些发现为HCC治疗提供了潜在的治疗靶点。
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