【佳学基因检测】基因检测如何指导视网膜色素变性的基因治疗

视网膜色素变性（RP）是一组遗传性眼病，主要影响视网膜中的感光细胞，导致视力逐渐丧失。基因检测在RP的诊断和治疗中发挥着重要作用，能够识别与疾病相关的特定基因变异，为个性化治疗提供依据。

1. 基因检测

基因检测通过对患者的基因组进行测序，识别与RP相关的突变。例如，CNGB1和RPGR基因的变异已被证明与常染色体隐性和显性RP相关。研究显示，CNGB1的变异可能占arRP病例的4%。此外，使用大型患者队列的基因组测序，可以发现更多与RP发病机制相关的新靶点，如SLC66A1和SLC39A12。

2. 基因治疗

基因治疗是RP治疗的前沿领域，旨在通过修复或替换缺陷基因来改善或恢复视力。近年来，科学家们利用AAV载体和CRISPR技术开发了多种基因治疗策略。例如，通过AAV载体恢复CNGB1的表达能够显著改善视力。此外，研究者们正在探索RPGR基因的修复方法，以恢复视网膜功能。

总的来说，基因检测和基因治疗的结合为RP患者提供了新的希望，能够在未来实现更有效的个性化治疗。

3.  常染色体显性连锁突变

常染色体显性遗传病是研究最多的亚型，因为它们的严重性；单个等位基因突变即可引起表型的改变。与常染色体显性视网膜色素变性（adRP）相关的突变占病例的50%至75%。因此，迫切需要针对这些基因开发新治疗方法。已知许多基因与adRP的发病机制有关。在《基因检测如何指导视网膜色素变性的基因治疗》中，总结了研究较多的基因（如RHO）及其他分子靶点的新进展。

3.1. 视紫红质诱发的常染色体显性视网膜色素变性

在视网膜色素变性（RP）患者中，最常见的突变之一是RHO基因突变，影响近25%的患者。近年来，针对视紫红质相关RP的治疗方法的临床前研究得到了大量关注。RHO突变引起的发病机制和生物分子变化已在细胞系和动物模型（主要是啮齿动物）中得到了深入研究。在建立了有效的动物模型后，科学界的兴趣转向了基因治疗载体的开发。

目前，针对表现出视紫红质突变的哺乳动物模型的研究取得了新进展，使得基因治疗的临床前阶段主要集中在adRP的治疗上。尽管如此，最近的研究在体内模型中更好地表征了RHO基因在RP发病机制中的作用。例如，在非洲爪蟾蝌蚪中，通过CRISPR-Cas9诱导的RHO突变显示，杆状细胞的变性是由于Müller胶质细胞增殖受抑制所致。在转基因大鼠模型中，脯氨酸被亮氨酸（P347L）取代后，视紫红质的积累导致外核层迅速破坏。此外，内质网应激通路在P347L转基因大鼠中通过显著上调CHOP和BiP mRNA的表达而被激活。

研究表明，在转基因小鼠和转基因猪中，视紫红质突变P347S会影响视紫红质向光感受器外段的转运。Mussolino及其同事使用锌指DNA结合结构域的转录抑制方法，通过含有KRAB（Krüppel相关框抑制物）结构域的AAV2/8载体成功转染RHO P347S转基因小鼠，导致ERG反应增强。该方法能够降低突变体的转录水平，而不改变内源性小鼠RHO基因的表达。最近的研究显示，将锌指与KRAB结构域融合，并结合由GNAT1启动子驱动的RHO cDNA，可以在载体递送后恢复RHO基因的野生型拷贝。Marrocco及其同事通过视网膜下注射成功抑制了含有突变RHO基因的猪体内的内源性表达，并用RHO的野生型拷贝取而代之，导致视网膜形态和功能的恢复。RNA替代疗法在动物模型中也显示出了有效性。使用P347S转基因小鼠模型的研究表明，通过载体递送shRNA可以替换突变的视紫红质RNA转录本，从而导致视紫红质水平的升高和随后的ERG反应增强。CRISPR-Cas9系统在S334ter-3大鼠中也取得了成功，该大鼠具有特定等位基因RHO S334的突变，治疗可改善视网膜的保存和视力。在RHO-P347S/Rd10和Rd10/Rd1小鼠中，分别通过视网膜下注射AAV-Cas9载体对Nrl和Nr2e3基因进行敲除，也获得了有希望的结果。NRL和NR2E3是参与视杆感光细胞分化和细胞稳态的关键因子，调节它们被证明是治疗RP的有效方法。miRNA水平的失调与RP的发病机制有关。miR-204突变与视网膜营养不良有关。Karali及其同事证明，在RHO-P247S转基因小鼠中注射AAV介导的pre-miR-204可以延缓视网膜退化，并减弱小胶质细胞活化和感光细胞死亡，从而增强视网膜功能。此外，基于mirtron的miRNA表达调控在RP小鼠模型中成功抑制了基因表达。在Nrl.GFP/+、Rho P23H/+小鼠中，视网膜下注射AAV-mirtron载体（即AAV-M3.M5 H.RHO M3/5R）已被证明可以诱导视紫红质mRNA的替换，从而部分挽救视网膜变性。此外，还研究了携带视紫红质基因突变的Tvrm4小鼠，以了解Myriocin（一种神经酰胺从头合成抑制剂）的作用。Myriocin可以降低视网膜神经酰胺，保持视网膜电图记录反应，并降低视网膜氧化应激，表明它可能通过解毒和支持细胞存活起到作用。

视紫红质T17M突变体参与内质网应激导致的未折叠蛋白反应（UPR）通路的异常激活，并诱导感光细胞死亡。在转基因C57BL6小鼠的研究表明，T17M视紫红质的表达会诱导IL-1β、IL-6和NFκB以及IB1A小胶质细胞标志物的上调。UPR通路的持续激活与感光细胞功能和视网膜结构的丧失有关。在C57Bl/6小鼠的研究中，单次敲低(ATF4 +/−) T17M就足以产生治疗反应，显著延缓视网膜变性，而双重敲低则增强了观察到的效果。T17M诱导的RP小鼠中ATF4缺乏与pEIF2α、ATF6和CHOP表达的下降有关。

3.2. 非视紫红质相关常染色体显性突变

前mRNA加工因子（PRPF）突变与多达20%的adRP病例相关。PRPF参与前mRNA剪接，且已知参与纤毛发生和DNA损伤修复途径。使用AAV相关的CRISPR-Cas9载体进行基因增强，结果表明Prpf31基因增强可恢复小鼠视网膜结构的完整性。在Rpgr−/y Cas9+/WT小鼠中，使用sgRNA（Cas9）和AAV载体进行Rpgr基因编辑可诱导光感受器的保存。

与adRP相关的RP1基因突变会破坏光感受器内的蛋白质运输、纤毛结构的维持和视盘膜的稳定性，最终导致光感受器细胞的死亡。最近，双Cas9/sgRNA被证明可以成功降低编辑后的Hap1-EF1a-RP1细胞中的RP1表达，为进一步的临床试验铺平了道路。

4. 常染色体隐性连锁突变

4.1. 视紫红质诱发的常染色体隐性视网膜色素变性

与adRP的遗传形式类似，许多RHO突变已被证明与经典形式RP（例如adRP）相关，而只有少数与隐性形式相关。根据基因检测结果，adRP的RHO突变通常分为七类。然而，只有五个RHO突变被证明与常染色体隐性视网膜色素变性（arRP）相关。与视紫红质相关的arRP的五个已知变体包括E150K、W161ter、E249ter和M2531突变。佳学基因检测还在视力障碍患者中发现了与RHO相关的错义突变（E150K）。敲入小鼠模型表明，E150K 突变会损害视紫红质的稳定性，导致进行性视网膜变性。这些观察结果可以在基因解码的帮助下，通过混乱的感光器盘结构随后损害正常的吞噬作用来解释。纯合 E150K 小鼠的视网膜中 Müller 细胞活化程度更高，巨噬细胞和小胶质细胞也更多，这为视网膜免疫激活提供了证据。发现两个无义突变（E249ter 和 W161ter）与 arRP 有关。使用转染了视紫红质无义突变体的 HEK293 和 HT1080 人细胞系检测到了较低水平的视紫红质 mRNA，提示存在无义介导的衰变（NMD）；用已知的 NMD 抑制剂 Wortmannin 处理细胞，可恢复视紫红质 mRNA 水平。M2531 视紫红质突变体被证实与 arRP 形式有关，来自土耳其近亲血统的杂合子患者无症状 。佳学基因检测进一步研究以更好地了解常染色体隐性突变在 RP 发展中的作用和影响。

4.2 非视紫红质相关常染色体隐性突变

基因解码基因检测发现，CNGB1基因的序列变异与常染色体隐性视网膜色素变性（arRP）有关，约占该病症病例的4%。最近对CNGB1变异的基因检测结果的综合分析指出，共有62种遗传变异与遗传性视网膜疾病相关。基因解码基因检测表明，利用AAV载体恢复Cngb1−/−小鼠的CNGB1表达能够改善视力，这些小鼠在视杆依赖性视觉引导行为测试中表现优异 (pp.733–739)。此外，视网膜的变性速度显著减缓，形态得以保持。

基因检测还发现，TULP1突变与早发性视网膜变性相关，尽管其具体发病机制尚未完全阐明。近年来，研究人员开始关注使用斑马鱼模型来探讨各种视网膜疾病的致病机制。他们建立了Tulp1表达的单敲除（Tulp1 +/−）和双敲除斑马鱼模型，并发现下调微管成分tektin2会显著影响纤毛的形成。通过AAV介导的TULP1基因表达编辑，成功恢复了TULP1 mRNA和蛋白质水平。然而，TULP1的基因表达恢复并不足以改善Tulp1 −/−小鼠的外核层厚度。

开发新动物模型用于基因治疗是药物发现的一个重要途径。最近，Beryozkin及其同事成功创建了Fam161a缺乏的小鼠模型，这些小鼠显示出视网膜变性表型及增加的小胶质细胞等分子生成标记。同样，纯合Fam161a p.Arg512∗小鼠因外核层完全丧失和感光细胞死亡而出现视力改变。

RPGR基因已被证实与隐性RP相关，是研究最广泛的基因之一。尽管AAV载体在治疗方面显示出良好的临床前潜力，但研究者们仍在探索多种基因治疗方法。最近的研究使用rd9小鼠模型，注射AAV引导的CRISPR-cas9载体，成功恢复了RPGR ORF15的阅读框。

5 识别与视网膜色素变性有关的基因靶点，用于新型基因治疗

为了开发未来的基因疗法，通过致病基因鉴定基因解码识别与RP发病机制相关的新基因显得尤为重要。针对大型患者队列的基因测序研究为未来的基因靶点提供了重要线索。近年来，多个研究通过基因组测序揭示了可能与RP发病机制相关的多种基因。例如，佳学基因通过分析以色列和巴勒斯坦的遗传性视网膜疾病病例，发现了两个新的靶点：SLC66A1和SLC39A12 。其他SLC基因变体也与RP相关；SLC7A14基因敲除小鼠表现出视网膜变性和视觉功能障碍，表明该基因在视网膜发育中发挥重要作用。ATP/GTP结合蛋白的稀有杂合变体（如AGBL5的p.Arg281Cys和p.Arg487*）也可能与RP相关。总体而言，这些新基因在RP中的病理生理学仍需进一步研究。关于导致视网膜疾病的基因及其定位位点的最新列表，可在《视网膜相关疾病及其基因突变位点列表》。

6 RNA替代疗法

基因检测与视网膜变性基因治疗的研究正在不断进展，特别是在RNA替代疗法方面。RNA替代疗法的目标是消除内源性突变RNA，这一过程涉及非编码RNA（ncRNA）的调控。ncRNA主要分为微小RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA）。其中，miRNA通过结合靶信使RNA（mRNA）的结合位点来调控转录后修饰，从而抑制翻译并导致mRNA的不稳定。siRNA与miRNA有相似的作用机制，但其结合能力更为特异，可以识别单个核苷酸差异。shRNA在基因治疗中则主要用于DNA递送。

在视网膜色素变性（RP）的治疗中，多个基因突变被发现与其发生相关。尽管目前尚无治愈RP的疗法，研究者们正在开发针对特定基因的药物（如基因疗法），以挽救细胞并支持人工视网膜的维持。

基因突变的作用机制和信号通路的研究为新药的开发提供了基础。例如，通过CRISPR-Cas9技术对特定基因的编辑，能够在模型生物中恢复视网膜功能。这些新发现为RP的治疗开辟了新的可能性。

总之，基因检测和基因治疗结合了最新的分子生物学技术，为治疗遗传性视网膜疾病带来了新的希望。