佳学基因病源体基因检测项目mNGS对现有技术的革新

1）传统方法介绍

传统的病源体检测是采用涂片镜检的方法，是指将待检样品取材、制片后在显微镜下观察、分析和判断样品中微生物种类的一种临床诊断方法，通常用于疾病的初步判断。人体的排泄物、分泌物或病患组织都可以作为检查对象。常见的涂片镜检有革兰氏染色法，可检出革兰氏阳性菌（如肺炎双球菌、炭疽杆菌）、阴性菌（如百日咳杆菌、痢疾杆菌）。经过包括初染、媒染、脱色、复染等步骤后，革兰氏阳性菌呈现紫色，革兰氏阴性菌呈现红色并且由于染色使得细菌的形态和结构特征更易于观察，从而更利于分类鉴定。

生化方法是通过检测微生物表达的特异性的酶，从而鉴定微生物种类的方法。使用特定的底物，检测微生物代谢底物的能力，即可判断微生物是否具有某种特定的酶。例如检测沙门氏菌的辛酯酶法。各属肠杆菌科细菌中只有沙门氏菌表达辛酯酶，根据这一特性，甄宏太等开发了快速检测沙门氏菌的辛酯酶法。该方法是以42甲基伞形酮辛酯（MUCAP）为底物，在沙门氏菌的酶促反应后，生成4MU，在紫外灯下可观察到蓝色荧光。该方法在数分钟内即可完成，适合病菌的初步筛查。

全自动微生物生化鉴定系统是一种集生化反应、计算机和自动化技术于一体的检测技术，具有速度快，通量高的优点。常见仪器如法国生物梅里埃公司的VITEK系统和美国BD公司的PHOENIX系统。自动化系统可进行多达几十种的微量生化反应和药敏生长试验，根据各生化反应孔中的生长变化及呈色反应情况，由计算机通过数值编码技术与数据库进行比较分析，得到鉴定结果。

免疫学检测是利用抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。既可以检测病原菌的抗原，也可以检测免疫细胞的抗体。抗原检测可以确认病原菌，而抗体检测则是病人健康评估的方法，两者相辅相成。通常将待检测的抗原（或抗体）结合蛋白预先连接上某种标记物，借助标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度，在光镜或电镜下进行定性、定位或定量研究。比如诊断肺炎时可通过肺炎链球菌和嗜肺军团菌尿抗原检测及血清隐球菌荚膜多糖抗原检测诊断医院获得性肺炎。

微生物培养是通过培养样品中的微生物再结合检测液体菌液浓度（对应固体培养基检测菌落数）、或联合生化或免疫学检测对微生物进行鉴定的方法。例如罗氏培养法可以用于诊断肺结核病。罗氏培养基可促进分枝杆菌的生长并抑制其他杂菌，经培养3-4周后分枝杆菌形成菌落，呈干燥颗粒状，乳白色或米黄色，形似花菜心。

2）mNGS与传统方法的比较

其他基于NGS方法介绍

PCR扩增后测序是扩增富集已知病原体基因片段之后再测序。由于只扩增部分基因，该方法的测序成本较mNGS更低。但该方法对于未知病源的感染无能为力。例如，16S rRNA是原核生物（比如细菌）核糖体的组成部分。核糖体是序列高度保守的基因，可将扩增引物设计在多物种共同的序列区域扩增16S rRNA片段，之后再测序、比对鉴定微生物类别。

目标DNA区域捕获并测序的方法与PCR扩增思路类似，通过筛选出部分基因进行测序，从而降低成本。区别是筛选基因的方法：通过设计核酸探针（生物素标记）互补结合到待测病原体的基因组区域，从而捕获特定的病原体基因组片段，继而对这些片段进行测序。

mNGS与其他基于NGS方法的比较

1）新兴方案介绍

PCR检测技术是利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，在DNA聚合酶催化下，以样品中提取的微生物基因组DNA为模板，选取特定微生物表达的特异基因设计引物，以是否能扩增出特异基因以及基因条带的位置来鉴定病原微生物种类的方法。例如对布鲁菌的bcsp31基因设计特异性引物再通过ＰＣＲ扩增可快速检测血液、组织等标本中是否含有布鲁菌。

质谱检测技术通过对待测样本进行检测，获得其蛋白质图谱，再与已知微生物构建的数据库的参考图谱进行比对，从而鉴定病原微生物的方法。

2）mNGS与其他新兴方案的比较

mNGS在临床中的应用

mNGS具有检测全面，正确率高，敏感度高和时间短的优势。鉴定样品中病原微生物时，mNGS可以补充或替代传统的生化、免疫和培养方法，更快更加正确地取得结果。更重要的是，传统方法在应对少见、罕见感染，新发性感染时常常束手无策，mNGS通过检测样品中全微生物物种，从而找出潜在的致病微生物，指导用药。

在新发传染病疫情中的应用

在新发传染病疫情的发现和控制中，mNGS发挥了越来越重要的作用。2011年德国产志贺毒素大肠杆菌（STEC）O104：H4暴发，没有相应诊断试剂及标准可用于该新亚型，给检测带来了极大的难度。在多个高通量测序系统合力开展了宏基因组测序分析后，成功完成了菌株的基因组序列的重建，迅速确认了致命德国肠出血性大肠杆菌O104：H4。至今，mNGS在多次疫情中检测出致病菌，起到了鉴别病菌、控制疫情的作用。

在感染性疾病诊断中的应用

mNGS用于感染性疾病的诊断新颖由加州大学Charles Y. Chiu团队于2014年报道，发表在《英格兰医学杂志》。1例14岁患者，头痛、发热反复住院8个月，在进行了38种不同的诊断试验（从血清学到培养和活检），仍然无法明确其致病病原体，并进入了昏迷状态。贼终团队使用mNGS检测其脑脊液样品，确诊为钩端螺旋体感染。随即给予针对性的青霉素治疗，32天后患者治好出院。此后该项技术广泛用于多种感染性疾病的诊断。

在神经系统感染性疾病中mNGS的报道

据估计经过全面深入的传统检查后仍有30%～60%的脑炎病例无法明确其病因。使用mNGS检测可检查出所有微生物，帮助诊断病毒性（DNA病毒和RNA病毒）脑炎。2015年，德国报道了3例基底节脑炎患者，患者临床上以基底节病变为主，发病急骤，死亡率高，通过mNGS在脑内检测到松鼠博尔纳病毒，这是新颖发现松鼠博尔纳病毒传染人类的证据。2015年，日本Sakiyama等报道了4例表现为脑脊髓膜炎的渔民，常规检查未能明确其致病病原体，通过mNGS检测发现其感染了以前从未曾报道的属于古细菌域的嗜盐菌（Halobacterium），在给予复方磺胺甲恶唑治疗后患者有效好转。上述报道均表明，mNGS检测在诊断罕见的、新发的或不典型的病原微生物（如钩端螺旋体、星状病毒、古细菌、博尔纳病毒）时发挥出了独特的优势，可以有效检测病原微生物并且指导用药。

在呼吸道感染性疾病中mNGS的报道

在呼吸道感染中，除血液标本外，mNGS已用于多种呼吸道多种标本的检测，包括痰、咽拭子、胸水、支气管肺泡灌洗液、脓液及肺活检标本等。

谢云等报道了一项关于mNGS技术应用于重症肺炎的病原体检测效果的回顾性研究，对照组及mNGS组共178例患者。对照组130例患者送检痰、血及支气管肺泡灌洗液标本做常规的微生物培养，根据培养结果调整抗菌药物使用；mNGS组48例患者加做mNGS，根据mNGS检测结果调整抗菌药物的使用。贼后以28天，90天死亡率为指标，mNGS组均显著低于对照组，说明在mNGS结果的辅助下，患者的见效率显著更高。胡必杰等报道了应用mNGS检测病原体的一项大样本回顾性研究分析，纳入可分析数据的511例患者。通过分析发现mNGS较传统培养方法敏感性提高近15%。

在小儿感染性疾病中mNGS的报道

王春花等人基于NGS方法优化的测序方法分别对94份重症病例和150份轻症病例临床样本进行了测序分析，共检出哺乳动物病毒科和植物病毒科共13种病毒。此外还检测出了多种肠道病毒不同型别之间、肠道病毒与非肠道病毒之间的混合感染事件，为手足口病的临床诊断提供了一种正确检测方法。严重急性呼吸道感染（Severe Acute Respiratory Infection, SARI）是儿童住院和感染死亡的重要原因之一。王延群等人对135份SARI儿童和15份非SARI儿童的呼吸道样品进行了mNGS测序 ，检测出病毒种类和主要病毒性病原，同时也通过比较病毒基因组学分析，发现感染组和对照组之间不同的病毒群落分布特点以及各个组内的特异性病毒特征。

应用病种流行病学特征

呼吸系统感染性疾病

国际呼吸协会论坛（Forum of International Respiratory Societies）于2017年发布了《全球呼吸道疾病概况》，介绍了全球前五大呼吸系统致死疾病的流行病学数据以及预防、控制和治疗方案，其中包括感染类疾病：下呼吸道感染和肺结核。

下呼吸道感染和肺炎每年会导致全球多于四百万人死亡，在低收入和中收入国家中尤其严重。2015年，有920,136名儿童（五岁以下，新生儿期以外）死于下呼吸道感染和肺炎，占该年龄段死亡人数的15%。这也是多年来早逝和住院治疗的第二大原因。每年流感病毒会导致5-15%的人群下呼吸道感染并且有三至五百万重症患者。呼吸道合胞体病毒（RSV）是贼常见的引起儿童急性呼吸道感染的原因，每年近3400万例，其中约90%RSV呼吸道感染死亡的儿童来自中低收入和中等收入国家。除RSV外，近几十年也有新的呼吸系统病毒出现，如2003年爆发的SARS病毒。

肺结核的发病率在以每年1.5%的速度递减，然而死亡率仍然高居不下，维持在17%。地区间死亡率差异较大，从5%到超过20%不等。2015年，肺结核共导致全球140万人死亡，是贼大的单传染源致死病和世界范围内贼大的致死疾病之一。2015年，合并HIV，肺结核的死亡人数达40万人。肺结核病例主要分布在20个国家，其中非洲中部和东南亚区域发病率较高。2015年新增肺结核病例数1040万例，其中100万例是儿童，并且由于儿科肺结核病诊断难度大，此数字可能被低估。2015年估计新增案例中约58万案例有耐药性，11%合并HIV感染。

神经系统感染性疾病

2018年6月，J Neurosurg杂志刊登了由哈佛医学院的Faith C. Robertson、BS等人关于中枢神经系统感染性疾病的研究。研究者对1990至2016年期间发表的关于中枢神经系统感染病例的文献进行回顾和荟萃分析，统计了发病率，描述了地区分布情况。报告共涉及10万个过往研究，共有约51万个案例，共计1.3亿人次。

根据世卫组织对区域的划分，非洲的细菌性脑膜炎发病率贼高（65例/100,000人），神经囊尾蚴病（650例/100,000人）和结核性脊柱炎（55例/100,000人），而东南亚的颅内脓肿发病率贼高（49例/100,000人），欧洲非椎板性脊椎椎间盘炎的发病率贼高（5例/100,000人）。有限的死亡数据显示结核性脑膜炎/脊柱椎间盘炎（21.1％）死亡率贼高，神经囊尾蚴病贼低（5.5％）。

报告指出各类中枢神经系统感染疾病的发病率和国家/地区收入相关。发病率低等收入国家>中等收入国家>高等收入国家。
 

病原体基因检测项目的样本采集

1、脑脊液、胸腹水、组织内浓液。直接在无菌下采集。采集后，需对采集管密封后，采用冷链在4度运输；

2、组织块：如考虑组织内感染，可以取黄豆粒大组织块，置于无菌组织管内，干冰冷链运输；

3、血液：采用带有核酸保护液的STRECK抽取受检者3-5ml静脉血，采用4度冷链运输；

4、组织、皮肤或者是器物表面：采用棉签拭待测区域表面。每一个区域需采用2个棉拭子。尽量刮取较大区域。将棉拭子置于无菌管内，采用4度运输到实验室。