【佳学基因检测】极微量(单细胞扩增)基因检测程序及步骤
试剂来源:
佳学基因致力于从多种来源的DNA样品中正确测定人体的基因序列变化,并对这些变化的生命密码进行解读和分析。是先进基因信息检测及解码技术的供应者,提供各种样本纯化和分析的方法和产品。先进的、高质量的产品和服务确保了从样本获得分析结果。
技术优势
对单个细胞或有限的样本进行高度均一的全基因组扩增(WGA)
采用多重置换扩增技术对基因组位点进行无偏差的扩增
适用于二代测序等新技术应用
产量稳定,可达40 µg(产物平均长度大于>10 kb)
可用于癌症、干细胞或宏观基因组学(metagenomics)研究
很多研究人员使用二代测序仪器对生物样本的DNA序列进行分析和基因分型,但经常受限于有限的样本量。佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术可均一的扩增单个细胞(1至1000个细菌或dota2吧雷电竞 细胞)或纯化的基因组DNA,能够覆盖基因组所有位点。另有专用于干血或新鲜或冷冻的组织样本的实验方案。所有缓冲液和试剂生产都经过严格控制的流程,避免污染DNA,确保每次实验获得高效的结果。该产品采用多重置换扩增(MDA)技术,对所有基因组位点进行无偏差的扩增。与基于PCR的全基因组扩增技术相比,该技术具有更好的扩增高保真度,避免出现假阳性或假阴性信号。
Performance
覆盖基因组所有位点,十分适用于二代测序和其他下游应用
佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术扩增的DNA平均长度大于10 kb,并且覆盖所有基因组位点。该产品已经过验证,适用于二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交(aCGH)和real-time PCR应用等多种下游分析。使用该产品无需单独进行PCR扩增,减少了手动操作,获得的产物长度PCR方法更长(参见"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods")。用扩增产物进行二代测序,获得高品质结果。这表明该试剂盒的位点覆盖率大,错配率低,其扩增的DNA(甚至从单一细菌细胞中扩增的DNA)能够与纯化获得的基因组DNA相媲美(参见"Comparable NGS results")。另有研究对人类常染色体和X染色体上的多个标记物进行了分析,三个独立的实验均显示:基因组的所有位点被成功扩增,没有遗漏任何一个位点(参见"Complete genome coverage")。
佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术的表现优于其他供应商的试剂盒
其他供应商的试剂盒基于PCR技术进行全基因组扩增,获得的产物片段较短,带有PCR引物序列,可能影响下游应用。基于PCR的全基因组扩增容易出现错误,会导致碱基对突变、STR的减少或增多,使用低保真Taq DNA聚合酶会导致位点缺失。相反,REPLI-g Single Cell Kit能够进行高度均一的全基因组扩增,位点偏差小。对四个试剂盒进行了检测,其中两个利用多重置换扩增技术(包括REPLI-g Single Cell Kit),另外两个利用PCR技术。采用单一细胞扩增实验方案对所有试剂盒进行序列位点检测。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供应商的试剂盒都出现了位点的遗漏(参见"Unbiased DNA amplification from a single cell")。
Principle
佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术含有REPLI-g sc Polymerase,这是一种优化的新型高保真Phi 29聚合酶。该试剂盒采用多重置换扩增技术扩增复杂的基因组DNA,温和的碱孵育能够避免DNA片段化,促进对所有位点的无偏差扩增。该试剂盒十分适用于分离的肿瘤细胞或细菌细胞等单一细胞,能够扩增获得高产量DNA(参见表1)。此外,该试剂盒还配有专用于鲜血或干血、新鲜或冷冻组织的实验方案,可用于多种研究样本。常规DNA产量可达40 µg,对模板的起始量要求低,因此进行后续遗传分析时无需检测DNA浓度。REPLI-g Single Cell Kit的扩增产物平均长度超过10 kb,且覆盖所有位点,适合于多种应用,包括二代测序、基于芯片技术的比较基因组杂交、焦磷酸测序和real-time PCR分析(参见表2)。
扩增原理
佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术采用等温基因组扩增技术,即多重置换扩增(MDA)。六聚体与变性DNA随机结合,然后在等温条件下,在优化的Phi 29聚合酶作用下,发生链置换合成反应。每个置换后的单链作为模板,与引物结合,可扩增获得高产量DNA(参见"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology")。Phi 29聚合酶为噬菌体衍生酶,具有3'→5'引物外切酶活性(校正活性),其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在优化的REPLI-g Single Cell缓冲液体系中,能够轻松的打开发卡结构等二级结构,因此可促进扩增时聚合酶正常工作。可扩增获得长达100 kb的DNA片段(参见"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase")。
细胞裂解和DNA的碱变性
基因组DNA在用于酶促扩增反应前必须经过变性,而这一变性过程通常使用高温或高pH值(强碱)孵育。佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术采用温和的碱孵育,在细胞裂解、DNA变性的同时,确保DNA片段化程度小,不产生碱基突变。因此扩增获得的DNA完整度高,产物长度长,覆盖位点多(参见"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation")。
高效去除可检测到的DNA污染
佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术中的所有组分都经过了独特的去污染流程,避免扩增产物被污染。在标准化流程中,对缓冲液和试剂进行紫外线照射,确保其不会污染DNA(参见"Innovative decontamination procedure")。紫外线照射后,对试剂盒的所有组分进行严格的质量控制,确保其性能。
Procedure
简单的单管操作
佳学基因极微量DNA全基因组扩增技术t可对单一细胞或有限的样本进行简便、高效、正确的全基因组扩增。反应体系构建十分便利、高效,仅需15分钟左右的手动操作(参见"REPLI-g Single Cell Kit procedure")。专用的缓冲液和试剂可对单一细胞、有限的组织材料、或纯化的DNA进行扩增,产量高、位点覆盖率大(参见表3)。REPLI-g技术扩增获得的DNA可在–20°C长期储存(参见"Consistent long-term stability")。
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