【佳学基因检测】地中海贫血基因检测

地中海贫血基因检测导读：

地贫在中国东南部地区发病率较高。这项为期 10 年的随访研究旨在确定中国东南部福建省地贫携带者胎儿样本中地贫的基因型和核型。共收集了 472 对携带 α 地贫特征的夫妇的 476 个产前样本和 223 对携带 β 地贫特征的夫妇的 224 个样本，进行 STR 分析、地贫基因型检测和核型分析。使用 Gap-PCR 检测法检测常见的缺失型 α 地贫和罕见地贫基因型，使用 PCR-RDB 检测法检测常见的β珠蛋白基因突变。 476 例 α 地贫夫妇产前样本中，轻型 α 地贫患病率为 43.49%，中型和重型 α 地贫患病率为 26.05%，罕见型 α 地贫患病率为 1.89%；224 例 β 地贫夫妇产前样本中，85 例胎儿为 β 地贫杂合子，16 例为纯合子，21 例为双重杂合子，1 例为罕见的 β IVS−2−654(C→T) /Chinese G γ ( A γδβ) 0 基因型。核型分析显示 7 例胎儿核型异常。共终止妊娠 153 例，引产后利用胎儿脐带血进行地贫基因诊断与产前诊断结果一致。正常婴儿出生半年后未发现任何地中海贫血表型，α地中海贫血和轻型β地中海贫血婴儿无贫血症状或有轻微贫血症状，发育正常，而15名患有血红蛋白H病的婴儿出现中度贫血症状。地中海贫血基因检测的数据建议对携带地中海贫血特征的夫妇进行孕前地中海贫血筛查，特别是复合型和罕见型地中海贫血。

地中海贫血基因检测关键词

随访研究、产前诊断、中国东南部、地中海贫血、α-地中海贫血、β-地中海贫血

为什么要开展地中海贫血基因检测？

地中海贫血是一组因一种或多种特定珠蛋白链（通常是 α 或 β）合成不足或无法生成而引起的遗传性血液疾病。地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传性疾病，在地中海地区、中东、印度次大陆、东南亚和中国南部地区十分常见。全球约有 3.5 亿人是地中海贫血基因携带者，全球携带者的比例正在增加。地中海贫血有两种主要临床类型，包括 α 地中海贫血和 β 地中海贫血，这种遗传性疾病主要表现为慢性溶血性贫血、肠道铁吸收增加、α/β 珠蛋白链比例失衡、红细胞生成无效、代偿性造血扩增和高凝状态。

目前，地中海贫血的治疗主要取决于临床严重程度（重型地中海贫血、中型地中海贫血和轻型地中海贫血），传统治疗包括输血和铁螯合疗法，特殊情况下还可进行脾切除术；但迄今为止，尚无针对重型地中海贫血的有效治疗方法。对于携带地中海贫血基因的夫妇，在妊娠第一和第二个三个月进行产前诊断被认为是预防重型地中海贫血胎儿出生的最有效方法。在这项为期 10 年的单中心研究中，地中海贫血基因检测对地中海贫血携带者胎儿样本中地中海贫血的基因型和核型进行了鉴定，并跟踪了地中海贫血高度流行的中国东南部福建省的妊娠结果。

地中海贫血基因检测

2009 年 1 月至 2018 年 12 月期间，福建省妇幼保健院产前诊断中心共纳入了 695 对确诊为地贫的夫妇（其中 5 对为双胎妊娠）。其中 472 对携带 α 地贫特征的夫妇（其中 4 对为双胎妊娠）采集了 476 份产前样本，223 对携带 β 地贫特征的夫妇（其中 1 对为双胎妊娠）采集了 224 份产前样本，并进行了后续分析。

产前样本和胎儿DNA提取

孕周11～14周在B超引导下经腹腔穿刺采集绒毛37例，孕周16～24周在B超引导下经羊膜穿刺采集羊水537例（每例20 mL），孕周24～36周在B超引导下经脐带穿刺采集脐血126例，采用Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit（德国希尔登Qiagen公司）提取基因组DNA，用于后续实验。

短串联重复序列（STR）分析基因检测

从夫妇身上采集 EDTA 抗凝外周血样本，并使用血液和细胞培养 DNA Maxi 试剂盒（Qiagen；德国希尔登）分离基因组 DNA。使用人类三体（T21、T13、T18 和性）多倍体分析试剂盒（中山大学达安基因有限公司，广州，中国）进行多重 PCR 检测，以扩增Amelogenin基因和 14 个 STR 焦点，包括 13 号染色体上的 4 个焦点（D13S628、D13S742、D13S634 和 D13S305），18 号染色体上的 4 个焦点（D18S1002、D18S391、D18S535 和 D18S386），21 号染色体上的 3 个焦点（D21S1435、D21S1411 和 D21S11）和性染色体上的 3 个焦点（DXS981、DXS6809 和 X22）。然后，用 ABI 3130xl DNA 测序仪（Applied Biosystems；美国加利福尼亚州福斯特城）上的毛细管电泳检查扩增产物，并鉴定是否存在母体细胞污染。

常见缺失型α地中海贫血的检测

使用地中海贫血基因检测试剂盒按照制造商的说明，采用 Gap-PCR 检测三种常见的缺失型 α 地中海贫血，包括- -SEA、 -α 3.7和 -α 4.2 突变、α珠蛋白基因中的8和 3 点突变，使用聚合酶链反应-反向斑点杂交 (PCR-RDB) 检测法，使用地中海贫血基因检测试剂盒按照制造商的指南进行鉴定，包括 αQS 、 α CS、 α QS和 α WS缺失。

常见β珠蛋白基因突变检测

使用地中海贫血基因检测试剂盒按照制造商的说明，采用 PCR-RDB 检测方法检测了17 种常见的β珠蛋白基因突变。

罕见地中海贫血基因型的检测

采用Gap-PCR检测缺失型α地中海贫血的‐‐THAI /αα和‐27.6 /αα基因型，并采用地中海贫血基因检测试剂盒按照制造商的说明，采用Gap-PCR检测缺失型β地中海贫血基因（东南亚、中国和台湾缺失突变）。

核型分析基因检测

常规取绒毛、羊水、脐带血样本进行培养、封片、G显带分析，采用GSL-120 Streamlines细胞遗传学分析系统（德国曼海姆徕卡公司）进行核型分析，每例至少计数20个核型，随机选取5个核型进行分析。

妊娠结局随访

对 695 对夫妇进行产前诊断一年后电话随访，了解重症地中海贫血胎儿的结局。此外，对非重症地中海贫血胎儿在出生一年后进行表型和发育情况的随访，以验证产前诊断的准确性。地中海贫血基因检测将血红蛋白 Bart 胎儿积水综合征和血红蛋白 H 病定义为重症 α 地中海贫血，将突变纯合子和双重杂合子定义为重症 β 地中海贫血。

地中海贫血基因检测结果

产前样本的 STR 分析和地中海贫血的严重程度

700 份产前样本中，476 份来自 α 地中海贫血胎儿样本，包括 29 份绒毛样本、368 份羊水样本和 79 份脐带血样本；224 份来自 β 地中海贫血胎儿样本，包括 8 份绒毛样本、169 份羊水样本和 47 份脐带血样本。羊水是地中海贫血基因检测中产前样本的主要类型（图 1)。对这些产前样本进行STR分析表明，没有受到母体细胞污染。

图1：2009 年至 2018 年中国东南部福建省地中海贫血携带者的产前绒毛、羊水和脐带血样本比例

在来自 695 对地中海贫血夫妇的 700 个产前样本中，在来自 α 地中海贫血夫妇的 476 个产前样本中检测到 136 个正常胎儿、210 个轻型地中海贫血胎儿和 130 个中型和重型地中海贫血胎儿；在来自 β 地中海贫血夫妇的 224 个产前样本中检测到 101 个正常胎儿、85 个轻型地中海贫血胎儿和 38 个中型和重型地中海贫血胎儿（图 2）。

图 2：2009 年至 2018 年中国东南部福建省地中海贫血携带者的产前绒毛、羊水和脐带血样本中检测到的 α 地中海贫血和 β 地中海贫血表型。A，α 地中海贫血；B，β 地中海贫血

胎儿地中海贫血的基因型

476 份来自 α 地中海贫血夫妇的产前样本中，胎儿中检出 3 种常见的缺失突变、3 种非缺失突变以及罕见的-THAI和 -α 27.6 突变，其中 136 份样本（28.57%）胎儿正常，210 份样本（43.49%）为 α 地中海贫血次要基因型，130 份样本（27.31%）为 α 地中海贫血中间和主要基因型，包括 6 份样本为罕见形式，9 份样本（1.89%）为罕见形式的 α 地中海贫血（表 1）。

表1：476 份产前样本中检测到的 α 地中海贫血基因型

在来自β地中海贫血夫妇的224份产前样本中，胎儿中检测到8种常见的β地中海贫血基因型，包括101例正常胎儿，16例纯合子，21例双重杂合子，并发现了一种罕见的βIVS -2-654（C→T） /中国Gγ （ Aγδβ ） 0基因型 （表 2）。

表 2：224 份产前样本中检测到的 β 地中海贫血基因型

3.3. 染色体核型

700 例产前样本的核型分析显示 693 种核型正常，7 种核型异常，包括 1 例绒毛 G 显带显示‐‐SEA /‐‐SEA α 地中海贫血基因型和 (47, XX, +16) 核型，1 例脐血核型分析显示 β CD27−28 ( + C) /β N β地中海贫血基因型和 21 号易位三体 [(46, XX, rob (14;21) (q10:q10)]，4 例羊水样本 G 显带显示 αα/ααα 地中海贫血基因型和 (46, XN, inv(9) (p12;q13) 核型，以及 1 例羊水样本 G 显带分析显示，αα/ααα‐地中海贫血基因型为 (46, XN, 21P-) 核型（表 3）。

表3：700 例产前样本的核型分析及 7 种异常核型的详细信息

后续结果

695 名地中海贫血孕妇均未发生术后并发症，700 例妊娠中 153 例因地中海贫血而终止妊娠，其中包括 86 例胎儿携带‐‐SEA突变，5 例携带 ‐‐THAI / ‐‐ SEA基因型，24 例患有血红蛋白 H 病（包括 10 例携带‐‐SEA /‐α 3.7，5 例携带‐‐SEA /‐α 4.2，6 例携带−−SEA /α QS α ，2 例携带−−SEA /α CS α ，1 例携带‐‐SEA /‐α 27.6 基因型），16 例患有 β 地中海贫血突变纯合子，21 例患有 β 地中海贫血双杂合子，以及 1 例胎儿携带 β IVS−2−654(C→T) /Chinese G γ ( A γδβ）0 基因型。引产后采集胎儿脐带血进行地中海贫血的基因诊断，结果与产前诊断结果一致。

7例核型异常胎儿中，1例为(47，XX，+16)核型合并‐‐SEA突变及1例为21三体易位[(46，XX，rob(14;21) (q10:q10)]且基因型为β CD27−28(+C) /β N]终止妊娠，另5例核型异常胎儿继续妊娠。

所有正常胎儿、α地中海贫血和轻型β地中海贫血胎儿及15例血红蛋白H病胎儿均继续妊娠，产前诊断一年后电话随访发现，正常新生儿出生半年后未出现地中海贫血表型，α地中海贫血和轻型β地中海贫血新生儿无贫血症状或有轻微贫血症状，发育正常，15例血红蛋白H病新生儿出现中度贫血症状。
 

地中海贫血基因检测的作用和意义

福建省位于我国东南沿海，是地中海贫血的高发省份。2013年分子流行病学调查显示，福建省地中海贫血总体患病率为4.14%，其中α地中海贫血和β地中海贫血的患病率分别为3.17%和1.32%。近期一项纳入189,414名受试者的研究结果显示，福建省地中海贫血总体患病率为6.8%，其中α地中海贫血和β地中海贫血的患病率分别为4.84%和1.87%，进一步证实了福建省是地中海贫血的高发省份。当前，加大地中海贫血的产前筛查和诊断力度，减少漏诊和误诊是我国地中海贫血防控的首要目标。

通过产前诊断防止重型地贫新生儿出生被广泛认为是预防地中海贫血的最有效方法。18自2013年 12 月全国免费地贫防治项目启动以来，福建省地贫高发地区开展了婚前、孕前及产前地贫筛查，同时加强地贫知识健康教育，旨在降低新生儿地贫患病率。在2009 年至 2018 年的 10 年研究期间，后 5 年接受产前诊断的胎儿数量（487 例）大约是前 5 年接受产前诊断的胎儿数量（213 例）的 2.3 倍。这是因为自 2013 年 12 月全国免费地贫防治项目启动以来，福建省地贫的覆盖范围大大扩大。总体而言，地中海贫血基因检测检测到 130 例胎儿患有严重形式的 α 地中海贫血（血红蛋白 Bart 胎儿积水综合征或血红蛋白 H 病），38 例胎儿患有严重形式的 β 地中海贫血（突变纯合子或双重杂合子）。地中海贫血基因检测的研究结果表明，对高危人群进行广泛的产前筛查可能会增加地中海贫血的发现率，这对降低出生缺陷的发生率是有效的。作为迄今为止规模最大的研究，这项为期 10 年的随访研究报告了对福建省地中海贫血夫妇的产前样本的分子分析，为地中海贫血的预防和控制提供了宝贵的数据。

目前临床用于产前诊断的样本主要有绒毛、羊水和脐带血。B超引导下腹腔穿刺可实现早期诊断，减轻孕妇心理负担，但该技术存在技术要求高、胎儿丢失率高的问题，难以推广应用。羊水是产前诊断的主要样本类型（约77%），对胎儿相对安全，地中海贫血的产前诊断大多通过超声引导下羊膜穿刺术实现。脐带血用于晚期产前诊断，对于超过羊水培养最佳时间，需要进行地中海贫血基因筛查和染色体诊断的个体是可行的，但该技术存在技术要求高、胎儿丢失率高、术中胎儿并发症多的问题。地中海贫血基因检测中羊水样本数量在研究期间呈上升趋势，而脐带血样本数量呈下降趋势。这归因于随着对地中海贫血知识认识的提高，地中海贫血的产前诊断大多在妊娠早期进行。

产前样本来源于母体，母体细胞污染可能极大地影响产前诊断的准确性。因此，产前样本包括绒毛、羊水和脐带血，在排除母体细胞污染后可用于产前诊断。地中海贫血基因检测对 700 份产前样本进行 STR 分析，结果未发现母体细胞污染，这些产前样本符合后续分析的条件。

地中海贫血基因检测在 476 例 α 地中海贫血夫妇的产前样本中，检测到了 91 例血红蛋白 Bart 胎儿积水综合征胎儿。血红蛋白 Bart 胎儿积水综合征是由于 4 个 α 珠蛋白基因缺失导致α 珠蛋白合成完全丧失所致，妊娠晚期发病可能导致宫内或产后胎儿死亡，以及浮肿、高血压、蛋白尿和产后出血等产妇并发症。另外5 例携带 ‐‐ THAI / ‐‐ SEA α 地中海贫血缺失的胎儿在超声检查中发现了血红蛋白 Bart 胎儿积水综合征。迄今为止，‐‐ THAI α 地中海贫血基因型仅在中国南方地区（如广东、广西、台湾和福建）有报道。由于α珠蛋白基因Thai 缺失不属于常规地中海贫血筛查范围，若无法获得血红蛋白 Bart 胎儿积水综合征的临床表现和基因检测结果，漏诊风险很高。地中海贫血基因检测诊断 5 例胎儿为 ‐‐ THAI / ‐‐ SEA缺失，其父母携带东南缺失，另 1 例胎儿未检测到常见缺失，最终确诊依靠血液学表型和胎儿超声检查。因此，对于原因不明、血液学参数异常的胎儿积水，应考虑 Thai 缺失型 α 地中海贫血引起的非免疫性 Bart 胎儿积水综合征，尤其是在中国南方，那里是地中海贫血的高发地区。目前，商品化的 α 地中海贫血检测试剂盒只能检测中国人群常见的 3 种缺失和 3 种突变类型，无法检测泰国的缺失型 α 地中海贫血。30因此，强烈建议将基因分型纳入地中海贫血的产前诊断中，因为精准的产前诊断对于预防地中海贫血的发展和遗传咨询至关重要。

目前医院对地贫的筛查以孕妇常规血液检测和血红蛋白分析为主，若孕妇筛查结果异常则其丈夫也要进行地贫检测，容易导致漏诊。地中海贫血基因检测 39例血红蛋白H病胎儿中， 30例为--SEA / -α3.7和--SEA / -α4.2基因型，8例为--SEA /αQSα和--SEA / αCSα基因型，1例为--SEA / -α27.6 基因型。提示α地贫仍然是福建省出生缺陷控制的重点，如果母亲携带α地贫-1型，且有典型的平均红细胞体积减少，则无漏诊风险；但如果母亲是α‐地中海贫血-2携带者，父亲是α‐地中海贫血-1携带者，则很可能出现漏诊，因为α‐地中海贫血-2携带者（轻型地中海贫血、无症状地中海贫血，尤其是血红蛋白恒定泉病）可能平均红细胞体积正常，血红蛋白分析没有特异性改变。因此，如果夫妇中一人确诊为地中海贫血基因携带者，另一人必须接受地中海贫血基因检测。在地中海贫血基因检测中，α‐地中海贫血‐α 27.6 基因型的病例在常规血液检测中没有异常；然而，在其家系成员中发现了血红蛋白A2（HbA2）水平显著降低和中度贫血，提示为血红蛋白H病，进一步的分子诊断显示为‐‐SEA /‐α 27.6基因型，这表明遗传咨询的重要性。这些数据表明，一些罕见的缺失类型未被常规检测试剂盒覆盖，由此造成的漏诊可能导致患有血红蛋白H病的胎儿出生。

地中海贫血基因检测纳入224例β地贫夫妇产前样本，共检测出8种常见β地贫基因型，其中101例胎儿β基因型正常，85例胎儿为杂合子，16例胎儿为纯合子，21例胎儿为双重杂合子，1例胎儿为βIVS −2−654（C→T） /中国Gγ（Aγδβ）0 基因型。对于夫妻双方均为β地贫携带者，其子女大多表现为经典的小细胞低色素性贫血和HbA2升高，漏诊可能性较低。由于β-地贫的表型可能覆盖α-地贫的表型，因此，α-地贫和β-地贫夫妇的胎儿需要同时进行α-地贫和β-地贫的基因诊断，以避免漏诊。地中海贫血基因检测中1例病例诊断为βIVS −2−654(C→T) /中国Gγ ( Aγδβ ) 0 基因型。β-珠蛋白基因缺失少见，但β-珠蛋白基因缺失携带者与β-地贫携带者结婚后，胎儿有患中型和重型β-地贫的风险。由于目前使用的β地贫基因检测试剂盒无法检测出β珠蛋白基因缺失，从而导致中型和重型β地贫的漏诊，因此，在对血红蛋白F水平明显增高的个体进行常见地贫基因产前诊断时，需要附加检测罕见缺失型β地贫基因，以避免中型和重型β地贫胎儿的出生。

地中海贫血基因检测对700例产前样本进行核型分析，发现2例胎儿羊水细胞培养存在核型异常，因此终止妊娠。因此，对有其他产前诊断阳性指征的孕妇，需重视其他遗传病的产前诊断指征，避免漏诊除地中海贫血以外的遗传病。

地中海贫血基因检测的意义和作用

总之，这项为期 10 年的大规模随访研究展示了中国东南部福建省地中海贫血夫妇产前样本的分子分析结果。因此，地中海贫血基因检测强烈建议对携带地中海贫血特征的夫妇进行地中海贫血（尤其是复合型和罕见型地中海贫血）的妊娠前筛查，此时应包括染色体异常的额外基因诊断。高危人群的产前诊断可以防止地中海贫血主要携带者的出生和不良妊娠结局的发生，保护患者的健康并提高人口素质。