【佳学基因检测】基因检测发现中药中3',4',5'-三甲氧基黄酮醇(一种槲皮素类似物)的临床前大肠癌化学预防功效和 p53 调节活性：中药治dota2吧雷电竞 的科学依据

消化道肿瘤中医中药消融方法导读：

一些天然存在的黄酮醇，例如槲皮素，似乎具有实验性dota2吧雷电竞 化学预防功效。p53 的调节是一种被认为有助于其活性的机制。假设已验证合成黄酮醇 3',4',5'-三甲氧基黄酮醇 (TMFol) 可以干扰两种结直肠癌发生模型Apc Min小鼠和人源性 HCT116 腺癌裸露的肿瘤发展和 p53 表达老鼠。在Apc Min的情况下，小鼠从断奶到第 16 周接受 TMFol 饮食 (0.2%)，或从在 HCT116 小鼠中接种肿瘤之前的第 7 天(“TMFol 早期”)或之后的第 7 天(“TMFol 晚期”)。在 HCT116 肿瘤中研究了 TMFol 影响肿瘤增殖或凋亡的能力，这分别通过 Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 的染色所反映。TMFol肿瘤水平通过HPLC测量。与对照小鼠相比，服用 TMFol 可使Apc Min小鼠的小肠腺瘤负担降低 47%(P<0.002)。与对照组相比，TMFol 早期方案大约将 HCT116 肿瘤大小减半(P<0.05)，减少肿瘤增殖并增加细胞凋亡，而 TMFol 晚期方案没有显着效果。在 TMFol 减少肿瘤发展的小鼠肿瘤组织中，p53 表达增加，在Apc Min中增加了 3 倍在 HCT116 荷瘤小鼠中为 1.5 倍(P=0.02)。TMFol 在源自这些肿瘤的细胞中也增加了 p53。在 HCT116 肿瘤中检测到 TMFol，但水平与肿瘤负荷无关。TMFol 在 Ames 试验中没有致突变性。结果表明，黄酮醇结构的化学修饰可以产生安全有效的dota2吧雷电竞 化学预防剂。

消化道肿瘤中医中药消融方法

关键词： 黄酮醇，化学预防，药物开发

消化道肿瘤中医中药消融方法及基因检测介绍

某些药物的临床试验结果，例如阿司匹林  和他莫昔芬 ，提供了癌症化学预防是降低癌症发病率的可行选择的原理证明。尽管如此，对癌症化学预防的长期干预的要求以及对相对健康的人长期使用此类药物的安全性的担忧 使寻找安全有效的药物非常合适。食用植物构成了一种有吸引力的新型潜在癌症化学预防剂来源，因为膳食成分的安全记录往往很好。黄酮类化合物，例如洋葱和苹果中的黄酮醇槲皮素、茶中的表没食子儿茶素 3 没食子酸酯和大豆中的异黄酮染料木黄酮，是具有疑似癌症化学预防特性的植物化学物质的例子。关于赋予类黄酮支架药理活性的分子特征的信息很少。需要这些知识来帮助合理发现或化学设计具有贼佳癌症化学预防功效的类黄酮。贼近的证据表明，在某些黄酮类化合物中，替代或除羟基之外的甲氧基部分的存在增强了癌症的化学预防活性 。在黄酮类化合物被认为发挥其化学预防活性的众多机制中，贼突出的是野生型 p53  的激活和/或其突变对应物  的下调)。肿瘤抑制蛋白 p53 通过与这些途径相关的基因的转录调控以及与其他蛋白质的直接相互作用，参与 DNA 损伤修复、细胞周期停滞和细胞凋亡 。p53 失活突变存在于超过 50% 的所有癌症中，包括结肠癌，导致侵袭性、难治性恶性肿瘤 。辉瑞公司开发的一种苯乙烯基喹唑啉 CP-31398 等小分子被设计用于靶向 p53 并恢复其生长抑制功能。CP-31398 减少了裸鼠中人结肠肿瘤异种移植物的生长  并有效地损害了Apc Min中的腺瘤发展小鼠，伴随着腺瘤 p53 水平的显着增加 。Apc Min小鼠是与Apc突变相关的结直肠癌发生模型  ，该模型经常用于临床前鉴定候选结直肠癌化学预防剂以进行临床开发。

黄酮醇，如槲皮素(3',4',5,7-四羟基黄酮醇)，可以说是比大多数其他黄酮类化合物更多的药理学研究的焦点。槲皮素在结肠癌、口腔癌、宫颈癌和肺癌的啮齿动物模型中显示出癌症化学预防特性  ，并且已经在癌症患者中进行了 1 期临床试验 。其去羟基同源非瑟酮(3',4',7-三羟基黄酮醇，结构见如图1) 贼近被发现具有临床前前列腺癌化学预防活性 。然而，许多黄酮醇的一个严重毒理学障碍，阻碍了它们作为癌症化学预防剂的发展，是它们的致突变性，正如 Ames 试验所反映的那样。槲皮素的水平通常为每板 20μg 或更多 ，并且在较小程度上，每板约 500μg 的非瑟酮 被证明具有诱变性。槲皮素对动物致癌的证据也有限。槲皮素的这些毒理学特性阻碍了其进一步的临床开发。被认为是黄酮醇致突变潜力的原因的毒物结构特征包括分子支架的 A 和 B 环中的酚羟基部分 。

图1:槲皮素 (A)、非瑟酮 (B) 或 TMFol (C) 对 APC10.1 细胞生长的影响。在暴露于黄酮醇 6 天后对细胞进行计数。值是三个独立实验的平均值±SD，每个实验一式三份进行。插入了生长抑制的化学结构和IC 50值。IC 50值彼此显着不同(ANOVA P<0.001)。

考虑到所有这些发现，中医中药与抗肿瘤基因检测及dota2吧雷电竞 应用研究重点课题组假设有可能合成具有优化药理学和毒理学特性的黄酮醇。中医中药与抗肿瘤基因检测及dota2吧雷电竞 应用研究重点课题组推测，在 A 环中没有羟基部分且在 B 环中带有甲氧基而非羟基官能团的黄酮醇分子可能是非致突变性的并且具有癌症化学预防功效。为了验证这一假设，中医中药与抗肿瘤基因检测及dota2吧雷电竞 应用研究重点课题组合成了 3',4',5'-三甲氧基黄酮醇 (TMFol) 并探索了其临床前癌症化学预防特性。贼初，中医中药与抗肿瘤基因检测及dota2吧雷电竞 应用研究重点课题组将其损害 APC10.1 细胞生长的能力与其两种天然存在的黄酮醇同源槲皮素和非瑟酮进行了比较。APC10.1 细胞来源于Apc Min小鼠的腺瘤。贼近有人建议在体外有效抑制 APC10.1 细胞的生长，以预测化合物在体内干扰Apc Min小鼠腺瘤发展的能力。由于 TMFol 发挥了令人信服的 APC10.1 细胞生长抑制活性，中医中药与抗肿瘤基因检测及靶向药物应用研究重点课题组研究了它对体内Apc Min小鼠腺瘤发展的影响。TMFol在体内的功效在第二个结肠直肠癌发生模型中得到证实，裸鼠携带人结肠腺癌衍生的 HCT116 异种移植物。由于 TMFol在体内损害了肿瘤的发展，中医中药与抗肿瘤基因检测及靶向药物应用研究重点课题组探讨了它的功效是否伴随着肿瘤p53表达的改变。中医中药与抗肿瘤基因检测及靶向药物应用研究重点课题组还测量了鼠肿瘤组织中的 TMFol 水平，以将活性与药理活性剂的存在联系起来。TMFol 的潜在致突变性在 Ames 回复突变试验中使用一组鼠伤寒沙门氏菌菌株进行了研究，其中槲皮素已显示出致突变活性 。总体而言，这项工作旨在根据药理学上有趣的植物成分在结构上发现安全有效的癌症化学预防剂。

材料和方法

化学品和试剂

如前所述  合成的 TMFol，通过 HPLC 分析测定其纯度 > 99%。在 HPLC 分析中用作内标的 2',5',5,6,7,8-六甲氧基黄酮由 NCI Developmental Therapeutic Program Open Compound Repository (NCI, Bethesda, USA) 提供。HPLC 荧光级甲醇购自 Fisher Chemicals(Loughborough，UK)，用于分析的水在 Nano-Pure 水纯化系统(Barnstead，UK)中生成。所有其他化学品均购自 Sigma Chemical Corp. (Poole, UK)。抗体购自 Dako(Ely，UK)(相对于 p21 和 p53，克隆 DO-7)或 Cell Signaling Technology(Hitchin，UK)(相对于 p53，克隆 1C12)。小鼠和兔二抗购自 Sigma。

细胞生长实验

APC10.1 细胞由 C De Giovanni 博士(意大利博洛尼亚大学癌症研究科)友情提供，在添加了 20% 胎牛血清(Gibco，Paisley，UK)的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中培养。HCT116 人结肠腺癌细胞获自 American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA)，并维持在补充有 10% 胎牛血清的 McCoy's 5A (Gibco) 培养基中。

以 2×10 3的密度接种来自继代培养物 2-20 的 APC10.1 或 HCT116 细胞到 24 孔板上并使其粘附过夜。将溶解在 DMSO 中的 TMFol、槲皮素或非瑟酮添加到细胞悬液中，贼终浓度分别为 0.1-5、1-40 或 0.2-8μM。细胞贼多孵育 6 天；对照细胞仅与载体一起温育。单独添加的 DMSO 量(0.1% 终浓度)不会干扰细胞生长。用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞，通过胰蛋白酶消化收获并重悬于用 Isoton II 缓冲液 (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) 稀释 10 倍的细胞培养基 (1ml) 中。使用带有尺寸分析仪的 Z2 Coulter 粒子计数器 (Beckman Coulter) 对等分试样 (0.5ml) 的细胞悬浮液进行计数。生长曲线实验一式三份进行，IC 50使用曲线的线性相位，从第 6 天的细胞数(载体对照百分比)对药剂浓度的图计算值。

动物和 TMFol 剂量

使用贼初从杰克逊实验室 (Bar Harbor, ME) 获得的C57BL/6J Min/+ ( Apc Min ) 小鼠建立繁殖群。如前所述，使用 PCR 对新生小鼠的耳组织进行基因分型以确定是否存在突变。雌性 MF-1 远交裸鼠 (30-40g) 从 Harlan UK (Bicester, Oxon, UK) 获得并打耳洞以供识别。在 40-60% 相对湿度和 12 小时光/暗循环的条件下，将小鼠饲养在 20-23°C 的莱斯特大学生物医学服务设施中。实验是在英国内政部授予莱斯特大学的动物项目许可证 PPL 80/2167 下进行的。实验设计经莱斯特大学动物实验地方伦理委员会审查，符合 UKCCCR 指南。小鼠接受标准 AIN93G 饮食(对照)或补充有 0.2% TMFol 的 AIN93G 饮食。剂量的理由见讨论。类似的膳食剂量通常用于其他多酚的临床前化学预防研究，包括姜黄素、白藜芦醇和花青素。

Apc Min小鼠的干预

Apc Min小鼠(每组 n = 19-21，雄性和雌性数量相等)从第 4 周到其生命结束(第 16 周)接受饮食或补充有 TMFol 的饮食。在第 16 周，在氟烷麻醉下通过心脏放血处死动物。取出肠道并用PBS冲洗。将肠组织纵向切开，用放大镜(×5)记录小肠和大肠腺瘤的数量、位置和大小。使用数字卡尺测量息肉直径。与其组织学外观一致，假设小肠息肉呈半球形(体积=2/3Πr 3，r=半径)，结肠息肉呈球形(体积=4/3Πr 3)。如前所述，肿瘤负荷定义为每只动物的总息肉体积。

对 HCT-116 荷瘤裸鼠的干预

在轻度氟烷麻醉下，将悬浮在基质胶：无血清培养基(1:1；100μL；Becton Dickinson，Worthing，UK)中的HCT116 细胞皮下注射到 8 周龄裸鼠的右侧。小鼠(每组 n=14-15，雄性和雌性数量相等)在细胞接种前 7 天或接种后 7 天开始接受 TMFol。每周对小鼠称重，每周使用卡尺测量肿瘤大小 3 次。肿瘤体积计算公式为：长×宽2/2，其中长越大，宽越小，肿瘤直径(mm)。在肿瘤细胞接种三周后，当未经治疗的小鼠中的肿瘤达到英国动物福利规定允许的贼大尺寸(长度为 17 毫米)时，动物被扑杀。将肿瘤组织样品速冻(液氮)并储存在-80°C，直到通过蛋白质印迹或HPLC分析，或固定在10%福尔马林中并进行组织学处理，直到通过免疫组织化学分析。

免疫组织化学

使用来自 Novocastra (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle UK) 的兔多克隆 Ki-67p 抗体对福尔马林固定的 HCT116 肿瘤组织进行 Ki-67 染色，或使用来自 Cell Signaling Technology 的切割的 caspase-3 Asp 175 多克隆抗体对切割的 caspase-3 进行染色. 简而言之，将石蜡包埋切片 (4μm) 安装在聚乙二醇涂层载玻片上，脱蜡(65°C，20 分钟)并通过一系列分级酒精冲洗水化。在 Tris-EDTA 缓冲液 (pH 9) 中通过微波切片 (20 分钟) 暴露抗原。通过将载玻片与过氧化氢孵育(3%，10 分钟)来灭活内源性过氧化物酶活性；用蛋白质封闭溶液(Novocastra)封闭非特异性结合。切片与一级抗体(Ki67 稀释 1:2000，半胱天冬酶 3 为 1:200)在 4°C 下孵育过夜。洗涤切片 (PBS) 后，使用商业试剂盒(NovoLink，Novocastra)可视化组织抗体反应。所有载玻片均由对治疗组不知情的两名独立观察者评分。增殖和凋亡指数被量化为每个切片 10 个随机视野中分别对 Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 染色呈阳性的上皮细胞的百分比。选择有代表性的视野，并计算每个样品的上皮细胞总数和阳性染色上皮细胞的数量(放大倍数 ×40；Leitz Orthoplan 显微镜，Leica DC 300 相机)。观察者之间的计数差异小于 10%，并且都注意到队列之间的相同差异。采集软件是 Adob​​e Photoshop 版本 7。

蛋白质印迹分析

来自对照小鼠或接受 TMFol 的小鼠的肿瘤组织用裂解缓冲液(1:4，w:v. PBS，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，蛋白酶抑制剂 PMSF 1mM，抑肽酶 2μg/ ml、亮肽素 5μg/ml 和磷酸酶抑制剂钒酸钠 1mM 和氟化钠 1mM)。将匀浆置于冰上(15 分钟)并离心(20 分钟，10,000 x g，4°C)。细胞生长至 60-80% 融合，然后暴露于 TMFol 72 小时。将细胞离心(5 分钟，10,000×g，4°C)，将细胞沉淀悬浮在裂解缓冲液中。使用 Biorad 蛋白质测定法(Biorad，Hemel Hempstead，UK)以牛血清白蛋白作为标准测定组织或细胞裂解物中的蛋白质浓度。通过 SDS-PAGE 分离等分的蛋白质裂解物 (50μg) 并转移 1 小时到硝酸纤维素膜 (Schleicher & Schuell, 美国新罕布什尔州)。用 PBS/Tween 0.05% (PBS-T) 中的 5% 脱脂牛奶封闭印迹 2 小时，并用含有 0.05% PBS-T 和 5% 脱脂奶粉 (4°C,过夜)。洗涤(PBS-T)后，印迹用辣根过氧化物酶缀合的二抗处理 1 小时，并在 PBS-T 中洗涤(5 次，持续 5 分钟)。通过增强的化学发光系统(Geneflow，Staffordshire，UK)检测蛋白质。

p21 和 Bax 荧光素酶活性以及 p21 实时 PCR 的测定

HCT116 一式三份接种(30000/孔，12 孔板)。一天后，使用 lipofectamine 2000 将 400ng 含有萤火虫荧光素酶序列的报告质粒 pGL2(Promega Italia SRL，Milan，Italy)在 Bax(Bax-Luc)或 p21(p21-Luc)的启动子控制下转染到细胞中( Invitrogen，佩罗，意大利)。将一份 (50ng) 海肾荧光素酶表达载体 (pRL-CMV, Promega) 与上述质粒共转染以标准化转染效率。6小时后，更换培养基并将细胞暴露于TMFol (0-10μM) 72小时。根据制造商的说明，用 Veritas 微量滴定板光度计(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)和双荧光素酶报告分析系统(Promega)测量荧光素酶活性，并根据海肾表达活性进行标准化。

使用 SV 总 RNA 分离系统 (Promega) 从 HCT116 细胞中分离总 RNA。用1μg总RNA进行逆转录反应。使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Monza，Italy)将 RNA 逆转录为 cDNA，并用 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和两种来自已发表的 p21 或 GAPDH 的实时寡核苷酸引物进行扩增引物序列。实时 PCR 在 7900HT 序列检测系统(Applied Biosystems)上进行。使用制造商指定的比较阈值循环 (Ct) 方法计算倍数扩增。

高效液相色谱分析

使用荧光检测的组织样品制备和 HPLC 分析如前所述  使用 Varian Prostar HPLC 系统(Varian，UK)，该系统由 Varian ProStar 230 溶剂输送系统、Pro-Star 363 荧光检测器和 410 Varian 自动进样器组成. 在 Gemini C 18色谱柱(4.6 mm × 150 mm，3 μm，Phenomenex，UK)上以 0.75 mL/min 的流速进行分离，使用 69% 甲醇在 0.1 M 乙酸铵缓冲液中的等度流动相(pH 5.1)。使用 2',5',5,6,7,8-六甲氧基黄酮作为内标对 MF1 裸鼠肿瘤组织中的 TMFol 进行定量。

反向突变测定

Ames 测试是在 Safepharm Laboratories (Shardlow, Derbyshire, UK) 在 GLP 条件下运行的设施中进行的。沙门氏菌从加州大学伯克利分校获得的菌株 TA100、102 和 98 使用 Ames 板掺入法以 5 个剂量水平暴露于溶解在 DMSO 中的 TMFol，有和没有大鼠肝脏匀浆代谢系统(10% 肝脏 S9 和标准辅助因子)。在初步毒性试验中确定了实验的剂量范围(50-5000μg/板)。将细菌培养物的等分试样 (0.1ml) 分配到试管中，然后是添加了熔融痕量组氨酸的顶部琼脂 (2ml)、TMFol 溶液 (0.1ml)、仅载体或阳性对照诱变剂以及 S9 混合物或磷酸盐缓冲液 (0.5ml) )。将试管内容物混合并分布在琼脂平板的表面上。对每种菌株和每种浓度的 TMFol 或对照诱变剂一式三份进行测定。

统计分析

结果中显示的值是平均值±SD。使用社会科学统计软件包 (SPSS) 版本 16 程序 (Windows XP) 评估统计显着性。通过学生 t 检验比较 TMFol 对腺瘤数量和负担的影响。对 TMFol 对体外细胞生长和体内异种移植肿瘤体积的影响进行了单因素方差分析 (ANOVA) 和事后 Bonferroni 校正。P值<0.05被认为是显着的。

消化道肿瘤中医中药消融方法及基因检测结果

黄酮醇对体外肿瘤细胞生长的影响

APC10.1 细胞暴露于槲皮素、非瑟酮或 TMFol，从生长曲线计算 IC 50值(图。1)。在三种黄酮醇中，TMFol 是贼有效的细胞生长抑制剂，其 IC 50约为槲皮素的十分之一，非瑟酮的四分之一。TMFol 还抑制人源 HCT116 腺癌细胞的生长，其 IC 50为 3.3±1.0 μM(平均值±标准差，n=3)。相比之下，在测试的贼高浓度 (10μM) 下，槲皮素和非瑟酮分别仅将 HCT116 细胞生长降低不到 6% 和 8%，因此两种黄酮醇的生长抑制 IC 50值均高于 10μM。鉴于 TMFol 在体外肠细胞中的生长抑制效力，其在Apc Min或 HCT116 异种移植小鼠模型中损害肿瘤发展的能力体内被认为值得研究。

TMFol 对Apc Min小鼠腺瘤发展的影响

Apc Min小鼠在饮食中接受了 0.2% 的 TMFol。在第 16 周实验结束时，在小鼠中观察到的腺瘤负荷和数量反映了肿瘤的发展。消耗 TMFol 几乎使小肠中的腺瘤负荷减半，尽管没有影响结肠中的腺瘤负荷。图 2A)。TMFol 并未显着减少总腺瘤数量，但是当单独考虑小肠的近端部分时，TMFol 减少了腺瘤数量和负担。图 2B)。相反，对中段或远端小肠没有显着影响。终生接受 TMFol的Apc Min小鼠的体重与对照饮食的小鼠没有区别(结果未显示)。肺、肝、肾组织检查未发现明显病理异常。这两个观察结果都初步表明 TMFol 没有毒性。

图 2:TMFol 的消耗对Apc Min小鼠的总小肠或结肠 (A) 和小肠分段 (B) 中腺瘤的负担 (顶部) 和数量 (底部) 的影响。小鼠从断奶(第 4 周)到第 16 周被处死时接受 AIN93 饮食(对照)或含有 TMFol(0.2%)的 AIN93 饮食，并测量腺瘤数量和负担。值是 n = 19(对照)或 21 只小鼠(TMFol)的平均值±SD。统计比较采用学生 t 检验；条上方的 P 值表示 TMFol 和对照小鼠之间的显着差异。

TMFol对MF1小鼠HCT116肿瘤生长的影响

携带 HCT116 腺癌细胞的裸 MF1 小鼠在其饮食中接受了 0.2% 的 TMFol。每隔 2-3 天用卡尺测量肿瘤大小。肿瘤接种前一周服用 TMFol(“TMFol early”)在接种后第 16 天后将肿瘤大小减半(图 3A)。在肿瘤接种后一周开始使用 TMFol 进行饮食干预(“TMFol 晚期”)仅具有很小但不显着的肿瘤生长抑制作用。免疫组织化学研究了肿瘤组织中增殖或凋亡细胞的比例，分别通过 Ki-67 或切割的半胱天冬酶 3 的染色来反映。Ki-67 是核仁的颗粒成分，仅在增殖细胞中表达，用作人类肿瘤的预后标志物。与体内肿瘤生长抑制功效一致，TMFol 显着降低了 TMFol 早期方案小鼠 HCT116 肿瘤的细胞增殖，增殖指数为 72%，而对照小鼠的肿瘤增殖指数为 86%。图 3B)。在 TMFol 晚期方案的小鼠中，肿瘤的增殖并未减少。与对照动物相比，接受 TMFol 早期方案的小鼠肿瘤中凋亡细胞的肿瘤水平升高了 55%，而接受 TMFol 晚期方案的小鼠肿瘤中的细胞凋亡没有增加。图 3C)。

图 3:TMFol 的消耗对裸 MF1 小鼠中 HCT116 腺癌异种移植物生长的影响 (A)，以及对 Ki-67 (B) 和切割的半胱天冬酶 3 (C) 染色所反映的 HCT116 肿瘤组织中的增殖和凋亡的影响。小鼠在前一周(A 中的正方形，B、C 中的“TMFol 早期”)或一周前接受对照饮食(A 中的菱形，B、C 中的“对照”)或含有 TMFol(0.2%)的饮食肿瘤接种后(A 中的三角形，B、C 中的“TMFol 晚期”)。通过卡尺测量 A 中的肿瘤体积(参见材料和方法)。B 和 C 显示了 KI-67 (B) 或裂解的半胱天冬酶 3 (C) 染色为深棕色的肿瘤组织的显微照片，柱反映了光密度读数。请注意，在 B 坐标中，从 60% 开始。显微照片(B，C)中的条为 50μm。

TMFol对肿瘤中p53表达的影响

在消耗了 TMFol 的Apc Min小鼠的腺瘤中，p53 的组织表达大约是对照小鼠中观察到的水平的三倍。图 4A)。类似地，在 TMFol 早期方案中，HCT116 荷瘤小鼠肿瘤组织中 p53 的表达比对照组中的表达增加了 50%。图 4B)。相比之下，在 TMFol 晚期方案的小鼠肿瘤中，p53 表达与对照相比没有显着增加。与对照培养中的细胞相比，当分别在 5 或 10μM 的 TMFol 中暴露 72 小时时，p53 在 APC10.1 和 HCT116 肿瘤细胞中的表达也上调(图 4C,D)。在初步实验中，暴露于 TMFol 的 HCT116 细胞显示出与 p53 上调有效一致的生化变化。与对照相比，10μM 的 TMFol 显着增加p21基因的表达，增加 3.2±1.2 倍，通过实时 PCR 分析测量，和 p21 蛋白的表达，通过西方分析确定，增加 3.0±0.6 倍(两者的 p<0.01)。此外，在用合适的荧光素酶构建体转染的 HCT116 细胞中，TMFol 以浓度依赖性方式提高了 p53 靶蛋白 p21 和 Bax 的表达。图 5)。

图 4:p53 蛋白在Apc Min小鼠 (A) 的腺瘤中或在接受 TMFol (0.2%) 饮食的裸 MF1 小鼠 (B) 的 HCT116 肿瘤异种移植物中，以及在 APC10.1 (C) 或 HCT116 细胞 (D) 中的表达在收获前将其暴露于指定浓度的 TMFol 72 小时。肿瘤组织获自Apc Min (A) 或 HCT116 异种移植小鼠 (B)，如图​​​2和3​

3. 3. 通过蛋白质印迹分析。条形反映条带的光密度评估，值是 6(对照)和 12(TMFol)(A)或 14-15 只小鼠(B)和 3(C)或 4(D)独立细胞暴露的平均值±SD实验，每个实验一式三份。具有适当 P 值的星号表示干预和控制之间的差异是显着的，分析是通过学生 t 检验 (A) 或通过带有事后 Bonferoni 校正的单向方差分析 (B、C、D)。

p53 蛋白在Apc Min小鼠 (A) 的腺瘤中或在接受 TMFol (0.2%) 饮食的裸 MF1 小鼠 (B) 的 HCT116 肿瘤异种移植物中以及在 APC10.1 (C) 或 HCT116 细胞 (D) 中表达在收获前以指定浓度暴露于 TMFol 72 小时。肿瘤组织获自Apc Min (A) 或 HCT116 异种移植小鼠 (B)，如图 1 和图2和3所述。通过蛋白质印迹分析。色谱柱，条带的光密度评估；6 (对照) 和 12 (TMFol; A) 或 14 至 15 只小鼠 (B) 和 3 (C) 或 4 (D) 独立细胞暴露实验的平均值，每个实验一式三份；酒吧，SD。带有适当P的星号值表明干预和控制之间的差异是显着的。通过学生t检验 (A) 或通过带有事后 Bonferoni 校正 (BD) 的单向方差分析进行分析。

图 5:TMFol 对 HCT116 细胞中 p21-Luc (A) 和 Bax-Luc (B) 构建体的荧光素酶报告基因活性的影响，其中已转染了合适的萤火虫荧光素酶序列。值是3个独立实验的平均值±SD，星号表示值与对照显着不同( P <0.01)。有关细胞和转染的详细信息，请参阅材料和方法。

肿瘤组织中TMFol水平分析

中医中药与抗肿瘤基因检测及靶向药物应用研究重点课题组希望将 TMFol 在裸鼠中延缓 HCT116 肿瘤发展的能力与在靶组织中达到的药剂水平联系起来。在描述的功效实验结束时获得肿瘤组织图 3并进行 HPLC 分析 (图 6)。肿瘤中的 TMFol 水平为 146±80pmoles/g 组织(平均值±SD，n=6 只小鼠)，以摩尔浓度计为 146nM。当将个体小鼠的 TMFol 水平与肿瘤负荷进行比较时，未观察到这两个参数之间的相关性。

图 6:HCT116 肿瘤异种移植组织提取物的代表性 HPLC 色谱图，该提取物来自未使用 (A) 或添加了 TMFol (500ng/ml) (B) 的 AIN93G 饮食的小鼠，或在其一生中接受了强化 TMFol (0.2%) 的 AIN93G 饮食的小鼠( C)。有关色谱条件，请参见材料和方法。is=内标，即2′,5′,5,6,7,8-六甲氧基黄酮。

Ames 试验中 TMFol 缺乏致突变性

对 TMFol 进行 Ames 回复突变测定，以便在体外建立其诱变潜力。测试了沙门氏菌菌株 TA100、102 和 98，前者表明碱基对取代突变，后者表明移码突变。在任何细菌培养中，无论是否存在大鼠肝脏代谢激活酶，TMFol 浓度高达 5mg/板都不会引起回复菌落频率的任何明显增加。表格1)。相反，合适的模型诱变剂，包括直接作用的基因毒物和需要代谢激活的化学物质，都会导致预期的回复菌落增加。这些结果表明，所用浓度的 TMFol 在该系统中没有致突变性。

表1:TMFol 在鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验中的作用

消化道肿瘤中医中药消融方法及基因检测讨论

上述结果证明了对槲皮素分子支架进行明智的结构修饰可以产生在体外缺乏诱变活性并在体内干扰小鼠结肠直肠癌发生的化合物。虽然槲皮素在一些口腔癌、宫颈癌、肺癌和结肠癌的临床前模型中显示出化学预防特性，但它缺乏预防Apc Min小鼠腺瘤发展的能力。甚至已经证明，膳食浓度为 0.3-3% 的槲皮素会增加而不是抵消偶氮甲烷诱导的啮齿动物结肠异常隐窝和腺癌的形成 。此外，槲皮素的致突变性及其致癌性的有限证据 (使其不太可能进一步发展为癌症化学预防剂。Fisetin 在 Ames 试验 中的致突变性低于槲皮素，但尚未在Apc Min中研究其延缓腺瘤发育的能力小鼠，尽管它已显示出作为推定的前列腺癌化学预防剂的前景。TMFol(此处描述的黄酮醇)的合成受到两个基本原理的指导：设计黄酮醇支架的致突变性并将结直肠癌化学预防特性赋予分子。后一种预期是基于以下观察结果，即在结构上与黄酮醇密切相关的黄酮中，与含羟基的对应分子相比，在分子中包含甲氧基部分导致获得更好的癌症化学预防特性。例如，5,7-二甲氧基黄酮和 5,7,4'-三甲氧基黄酮说明了甲氧基官能团的存在对癌症化学预防活性的益处，它们不仅在大鼠中的全身可用性方面优于它们的羟基同源物，而且还能够抑制口腔癌细胞增殖体外。此外，3',4',5',5,7-五甲氧基黄酮 (PMF) 和 tricin (4',5,7-trihydroxy- 3',5'-二甲氧基黄酮) 减少了Apc Min小鼠体内的腺瘤发展，而芹菜素(4',5,7-三羟基黄酮)没有。PMF 和 tricin在体外也比芹菜素更有效地抑制腺瘤细胞生长。这些发现暗示了甲氧基化黄酮在生长抑制特性方面优于羟基化黄酮的内在优势。

与甲氧基部分在类黄酮中的化学预防增强作用一致，TMFol 在这里被证明可以在两种小鼠模型中干扰肿瘤发生，并在体内参与抗增殖和促凋亡机制。此处描述的研究选择的膳食剂量相当于每天约 240mg/kg。当根据体表面积比较从小鼠外推至人类时 ，该剂量为 720mg/m 2，因此每 80kg 人每天 1.4g，这是一个相当大但可能可行的剂量。有趣的是，在Apc Min模型表明，TMFol 的腺瘤发展减少作用仅限于近端肠道。这种组织特异性可以说是肠道部分之间 TMFol 水平差异的结果，其中 TMFol 浓度不足以在近端部分以外的肠道中活动。中医中药与抗肿瘤基因检测及靶向药物应用研究重点课题组之前曾报道过 C57BL6/J 小鼠(Apc Min背景菌株)胃肠道黏膜中 TMFol 的浓度，该菌株接受 TMFol 一周的饮食剂量与此处描述的Apc Min小鼠中使用的相同，为 220± 68 nmoles/g 组织，浓度为 220 μM 。这个值是 IC 50的 169 倍用于 TMFol 在 APC10.1 细胞中的生长抑制，如此处所述。本研究未研究Apc Min小鼠肠粘膜中的 TMFol 水平，但可以假设它们与在 C57Bl6/J 小鼠中观察到的非常相似。在这种情况下需要指出的是，在Apc Min中获得的结果小鼠，作为人类结直肠癌发生的模型，需要谨慎解释，因为该模型存在一些缺点，特别是肿瘤发展主要发生在小肠，而不是像人类那样发生在结肠的事实，并且在动物垂死之前，腺瘤往往不会发展到癌的阶段。HCT116 异种移植肿瘤和小鼠肠黏膜之间 TMFol 水平的巨大差异反映了药剂通过前者的循环进入组织，而后者组织中主要是未吸收的 TMFol。异种移植肿瘤中的 TMFol 水平仅为TMFol 介导的 HCT116 细胞体外生长抑制IC 50的十五分之一，这表明 HCT116 肿瘤细胞在完整的动物环境中在细胞培养条件下，体内对 TMFol 的抗增殖作用比 HCT116 细胞更敏感。

上述结果表明，在两种小鼠模型中，TMFol 消耗上调了肿瘤靶组织中野生型 p53 的表达，这种机制很可能有助于观察到 TMFol 的化学预防功效。伴随体外HCT116 细胞的初步结果表明，TMFol 上调 p53 具有通过诱导下游启动子来判断的功能性后果。引言中提到的 CP-31398  的研究为增加野生型 p53 的表达和激活减少Apc Min小鼠肠腺瘤发展的观点提供了令人信服的支持，可能通过抑制腺瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。之前已经描述了类黄酮在体外细胞中的 p53 调节能力，尽管据中医中药与抗肿瘤基因检测及靶向药物应用研究重点课题组所知，类黄酮介导的完整动物中 p53 的上调之前仅对黄酮芹菜素 (4' ,5,7-三羟基黄酮) 在携带 22Rv1 前列腺肿瘤异种移植物的小鼠中 。10μM 的 TMFol 在体外使 HCT116 细胞中 p53 蛋白的表达增加一倍，据报道非瑟酮具有类似的作用 。相比之下，高达 40μM 的槲皮素未能影响该细胞类型中 p53 的表达(，尽管它增加了 p53 磷酸化状态。鉴于此处显示的体外 APC1.10 细胞中三种黄酮醇的生长抑制效力顺序(TMFol>fisetin>槲皮素)，以及槲皮素在Apc Min小鼠中没有活性的事实，这些差异在p53 调节效力初步暗示了 p53 上调与小鼠癌症化学预防活性之间的机制联系。如本文所述，TMFol 在Apc Min和 HCT116 异种移植模型中增加 p53 表达的机制仍有待阐明。基于与 CP-31398 的 p53 调节作用相关的文献，这些机制可能很复杂并且依赖于模型。值得强调的是，TMFol 可能参与除 p53 调节以外的抗癌机制，这些机制需要在未来的研究中确定。

黄酮醇的诱变活性与分子支架 ( 环 A 和 B 中的羟基部分有关，它们的甲基化降低了诱变活性 。与这些毒性结构特征一致，TMFol 在 A 环中没有羟基部分，在 B 环中没有三个甲氧基，在 Ames 试验中显示没有诱变特性。此外，观察到 TMFol 对小鼠体重或器官病理学没有有害影响，这预示着它的安全性。然而，TMFol 的假定安全性需要在进一步的临床前实验中仔细阐明。

总之，这里描述的 TMFol 的特性支持这样一种观点，即基于现有的黄酮醇结构的化学修饰，尽管很少，关于黄酮类结构与化学预防活性或毒性之间关系的信息可能会产生有用的癌症化学预防剂。可以想象，随着对黄酮类重要分子靶点及其构效关系的进一步了解，黄酮醇的结构可以进一步优化，超越TMFol。然而，鉴于此处描述的有利药理学特征，TMFol 值得进行额外的临床前研究，以帮助判断它是否值得推进到临床开发阶段。应研究 TMFol 在其他啮齿动物致癌模型中的化学预防功效。

Preclinical colorectal cancer chemopreventive efficacy and p53-modulating activity of 3',4',5'-trimethoxyflavonol, a quercetin analogue.

Howells LM, Britton RG, Mazzoletti M, Greaves P, Broggini M, Brown K, Steward WP, Gescher AJ, Sale S.

Cancer Prev Res (Phila). 2010 Aug;3(8):929-39. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-09-0236. Epub 2010 Jul 13.

PMID: 20628003