【佳学基因检测】基因检测透明细胞肾dota2吧雷电竞中 von Hippel-Lindau 基因改变方法的改进

泌尿科基因检测与正确治疗导读：

目的

提供对透明细胞肾癌 (ccRCC) 独有的dota2吧雷电竞基因组中von Hippel-Lindau VHL基因的体细胞突变和启动子高甲基化的全面、透彻分析。确定VHL基因改变的流行率和改变亚型与患者和肿瘤特征之间的关系。

实验设计

作为在中国进行的一项大型肾癌病例对照研究的一部分，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队利用敏感的高通量方法（核酸内切酶扫描和 Sanger 测序）的组合，分析了 205 名特征明确、组织学证实的患者肿瘤活检组织中的VHL突变和启动子甲基化。 )，并分析VHL启动子中的 11CpG 位点。

结果

肾脏癌的靶向治疗特别行动团队在 82.4% 的病例中发现了突变，这是迄今为止报道的最高的 VHL 基因突变流行率。对 11 个VHL启动子 CpG 位点的分析显示，8.3% 的肿瘤是高甲基化的，并且都是突变阴性的。总共有 91% 的透明细胞肾细胞癌通过遗传或表观遗传机制表现出基因改变。对患者和肿瘤特征的分析表明，某些突变亚型与 Fuhrman 核分级、转移、淋巴结阳性和自我报告的肾癌家族史显着相关。

结论

使用这些正确、敏感和实用的方法检测VHL基因改变提供了证据，证明绝大多数组织学证实的透明细胞肾细胞癌肿瘤具有VHL基因的遗传或表观遗传改变，并支持VHL改变是透明细胞肾细胞癌癌变的早期事件的假设。这些发现还表明，VHL分子亚型可以在组织学相似的透明细胞肾细胞癌病例中为病因学、预后和转化研究提供肿瘤异质性的敏感标志物。

泌尿科基因检测与正确治疗介绍

在了解肾癌的遗传基础方面取得了相当大的进展。通过使用遗传连锁分析和定位克隆对家族进行严格分析，已确定与几种形式的遗传性肾细胞癌 (RCC) 相关的易感基因。RCC 最常见的亚型是常规透明细胞型 (ccRCC)，约占病例的 75%。在家族性和散发性透明细胞肾细胞癌中，VHL基因的等位基因失活已显示在大多数分析的透明细胞肾细胞癌中通过突变、甲基化和/或染色体丢失发生。

检查来自透明细胞肾细胞癌散发病例的肿瘤 DNA 的分子研究提供了强有力的证据，表明VHL改变是致癌过程中常见的早期事件。此外，特定类型的VHL突变可能与病因、疾病进展和预后有关。然而，几项研究已经检查了多个患者群体中的VHL改变，并报告了观察到的突变发生率的显着差异，范围为 50-71%。突变流行率的差异可能是由几个因素造成的，包括：i) 检查的患者群体，ii) 肿瘤组织病理学，iii) 样本中肿瘤与正常 DNA 的比率，或 iv) 采用的突变检测方法。例如，在分子研究中纳入非透明细胞肾细胞癌肿瘤预计会降低观察到的VHL突变患病率，因为VHL突变在其他类型的肾癌中很少见。

必须使用正确、灵敏和实用的高通量突变检测方法来分析大量特征明确的样本，以便将VHL突变的患病率、类型和位置与病因或预后风险因素相关联。以前的研究依赖于扫描技术，例如变性高效液相色谱或单链构象多态性，然后使用 Sanger 测序对变体进行注释。这些扫描技术都不能达到与毛细管电泳平台上荧光 Sanger 测序数据生成相匹配的吞吐量水平。

最近，已经开发出一种新的扫描技术，它比以前的方法具有关键优势，尤其是与 Sanger 测序结合使用时。核酸内切酶扫描利用从芹菜中纯化的酶（Cel I 和 II）来检测扩增的 PCR 产物中的突变。核酸内切酶在错配位点切割异源双链 DNA，消化物按其大小分开。切割产物及其大小不仅表明变异的存在，而且还提供其位置信息，从而在对 PCR 产物进行测序时可以快速轻松地识别突变。当前研究的主要目的是应用这种新的突变检测方法来分析VHL作为肾癌病因和生存的大型国际分子流行病学研究的一部分收集的一组肿瘤样本中的基因突变，选择代表组织病理学变量和已知肾癌风险因素的分布。第二个目标是提供全面的遗传和表观遗传分析，以阐明体细胞突变与VHL启动子高甲基化之间的关系ccRCC特有的癌症基因组中的基因。这一目标将通过仅使用从冷冻组织切片中提取的 DNA 来实现，这些切片是由 NCI 肾肿瘤病理学 (MM) 专家通过组织学证实的透明细胞病例 (ccRCC) 使用分析组合有效搜索和确认所有突变来实现的。方法实用、灵敏但适用于大量病例分析.

泌尿科基因检测与正确治疗材料和方法

肿瘤DNA

从在中国和东欧进行的肾癌大型病例对照研究中纳入的病例中的一部分患者肿瘤样本（N=205）被选中，以包括按肿瘤分期、等级和已知风险因素（如性别、体重指数（BMI）、高血压、吸烟。肾脏癌的靶向治疗特别行动团队根据国家癌症研究所、国际癌症研究机构和当地机构审查委员会获得了潜在参与者的知情同意。在病理检查后进行肿瘤 DNA 提取，并进行手动宏观解剖以去除非肿瘤组织。似乎包含至少 70% 肿瘤细胞的样本区域用于 DNA 提取。对于每个样品，5 mm 3将组织切片并在 50°C 下用每 μl 消化缓冲液（500 mM KCl、100 mM Tris-HCl、15 mM MgCl 2、0.5% Tween 20）用 0.4 μg 蛋白酶 K 消化。使用标准方案1从消化的样品中提取 DNA。使用 ND-1000 分光光度计 (Nanodrop, Wilmington, DE) 对 DNA 进行定量。

聚合酶链反应

使用 10-15 ng 肿瘤 DNA 和 1.25 U HotMaster Taq DNA 聚合酶（Eppendorf，Westbury，NY）或 Hot-Start Taq DNA 聚合酶（Denville Scientific，Metuchen，NJ）在 50 μl 反应中扩增患者肿瘤 DNA使用各自的 1x 反应缓冲液和 0.2 mM 的每种 dNTP，以及 0.2 μM 的正向和反向引物。使用 MJ Research (Bio-Rad, Waltham, MA) Dyad 和 Tetrad DNA 引擎以及 95°C 2 分钟、10 个着陆 PCR 循环、然后 30 个 95°C 30 秒循环的程序完成热循环， 58°C 30 秒，68°C 30 秒；然后在 68°C 下进行最后 5 分钟的延伸。PCR 产物使用 95°C 的程序进行异源双链化 5 分钟，以 -2.0°C/秒冷却至 85°C，以 -0.2°C/秒冷却至 25°C，然后在 4°C 下孵育热循环仪。

核酸内切酶扫描

将异源双链 PCR 样品与 15 U 的 Surveyor Nuclease W 和 1 μl Surveyor Enhancer W（Transgenomic，Omaha，NE）结合，并在 42°C 下孵育 20 分钟。通过添加 2 μl 终止溶液（0.5 M EDTA，pH 8.0）终止消化，并在配备有高灵敏度检测系统和 DNASep® HT 柱（Transgenomic）的 WAVE® HPLC 仪器上进行分析。运行参数是在 50°C 烘箱温度下使用双链大小的多片段应用的 12 μl 注射体积。补充方法中描述了 WAVE HPLC 梯度参数. 紫外检测为 260 nm，荧光检测为 495 nm 激发/537 nm 发射。运行 100 bp DNA 梯（New England Biolabs，Ipswich，MA）作为大小标记。使用 WAVE Navigator 软件进行仪器控制、数据采集和数据分析。每个 PCR 产物板都包括阳性和阴性对照，以监测核酸内切酶切割效率。

VHL基因测序

使用 Ampure PCR Purification system (Agencourt Bioscience, Beverly, MA) 从 10 μl PCR 产物中去除多余的 PCR 引物。纯化产物在 30 μl 去离子水中洗脱。使用 BigDye v. 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 的反应化学和循环测序改编自制造商的建议。使用 CleanSeq 试剂 (Agencourt Bioscience Corp., Beverly, MA) 纯化循环测序产物。纯化的测序产物在 40 μl 0.01 μM EDTA 中洗脱，30 μl 在 ABI 3100 遗传分析仪上运行。通过增刊中描述的几种方法分析序列色谱图。方法。

VHL启动子甲基化

使用标准方法对 100-500 ng 肿瘤 DNA 进行亚硫酸氢盐修饰（Zymo Research Labs，Orange，CA）。引物（补充方法）) 旨在扩增 VHL 启动子的 11 个 CpG 二核苷酸的甲基化和未甲基化等位基因。在 MJ Research PTC200 热循环仪中对 2 μl 处理过的 DNA 进行 PCR：在 95°C 下变性 5 分钟，在 50°C 退火温度下进行 10 个循环，然后在 95°C 下进行 35 个 30 秒循环，30 秒在 50°C 下，在 72°C 下 60 秒，然后在 72°C 下最后延伸 5 分钟。使用上述循环条件对 1 μl 1:10 稀释的第一轮产物进行巢式 PCR。PCR 产物 (5 μl) 在 2.0% 琼脂糖中可视化并进行双向测序。在色谱图中检查 CpG 中的胞嘧啶位置的胸腺嘧啶或胞嘧啶信号如下：仅 T，未甲基化；胞嘧啶和胸腺嘧啶，部分甲基化；仅 C，有效甲基化。包含至少 4 个分析的甲基化 CpG (>36%) 的肿瘤样本被认为是甲基化的。所有分析均一式两份进行，不知道VHL突变状态，阳性（CpGenome Universal Methylated DNA, Chemicon/Millipore, Billerica, MA）和阴性（K562 Human Genomic DNA, Promega, Madison, WI）对照。

亚克隆

PCR 产物的克隆利用拓扑异构酶激活的载体和 TOPO 克隆试剂盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)。通过菌落 PCR 制备扩增的插入片段，并在量化含有突变等位基因的克隆数量之前如上所述进行测序。

统计分析

VHL突变和启动子甲基化被认为是每个病例的二分变量（否/是）。肿瘤和受试者特征，例如临床分期、等级、淋巴结分期（N0、N1、N2）、体重指数（BMI）（<25、25-35、35+）、吸烟包年数（0、1-20 , 20+) 和吸烟状况 (从不, 以前, 当前), 被认为是分类变量。其他变量，如转移（M0，M1）自我报告的高血压（无/是），癌症家族史（无/是-肾脏和无/是-任何），性别和诊断时的年龄（<50，≥50年）被认为是二分变量。VHL的患病率变更的计算方法是将发生变更的病例数除以分析的病例总数。缺少信息的病例被排除在分析之外。卡方检验应用于列联表（2×2）分析，以检验每组有无改变的病例数之间的差异。有序逻辑回归用于分析分类变量与具有特定VHL改变的病例之间的关联。所有分析均使用 STATA 9.0（Stata Corporation，College Station，TX）进行，所有统计测试都是双向的。

泌尿科基因检测与正确治疗结果

试验研究

从 22 个肾癌患者肿瘤中提取的 DNA 具有先前特征的VHL基因突变，用于比较内切酶扫描相对于 DHPLC 的特异性和敏感性。使用这两种技术检测所有突变。为了评估核酸内切酶扫描的敏感性，将来自六个具有已知突变的肿瘤 DNA 样品的 PCR 产物的系列稀释液与正常扩增子组合并进行分析。这两种技术都成功地检测到了含有 3-5% 突变/正常 DNA 的 DNA 稀释液中的突变（数据未显示）。

患者和肿瘤特征

病例的选择包括性别分布、诊断年龄、组织病理学参数（如肿瘤分期和分级）以及该人群中普遍存在的其他肾癌风险因素，如高血压、高 BMI、吸烟和家族史癌症。表格1提供了本研究中包括的病例的患者和肿瘤特征的频率分布。大多数病例（63%）来自捷克共和国。在整个研究人群中，性别、吸烟习惯、BMI 类别和高血压患病率相似。

表格1:本研究病例中患者和肿瘤特征的分布

	ñ	%
总病例	205	100%
中心
罗马尼亚	36	18%
波兰	21	10%
俄罗斯	19	9%
捷克共和国*	129	63%
性别
男性	122	60%
女性	83	40%
吸烟状况
绝不	89	45%
曾经	110	55%
体重指数†
<25	54	26%
25-35	147	72%
>35	4	2%
自我报告的高血压
不	108	53%
是的	97	47%
肿瘤阶段
T	42	20%
T2	92	45%
T3/T4	54	26%
失踪	17	8%
转移
MX	37	18%
M0	148	72%
M1	9	4%
失踪	11	5%
福尔曼核级
我	2	1%
二	154	75%
三	39	19%
四	3	1%
失踪	7	3%

*捷克中心包括布尔诺、奥洛穆茨、布拉格、捷克布杰约维采

†采访时的体重指数 (BMI)

VHL突变分析

所有突变和 SNP 的详细注释可以在补充表 1中找到。内切酶消化分析的代表性结果显示在补充图 1 和 2a-f中。使用 Navigator 软件，通过将消化图谱与大小阶梯叠加来确定内切核酸酶切割产物大小。这允许在序列色谱图中快速定位变体。肾脏癌的靶向治疗特别行动团队观察到使用核酸内切酶鉴定的突变与在正向和反向测序色谱图中检测到的突变之间存在 100% 的一致性。总体而言，VHL在 82.4% (169/205) 的病例中发生突变（表 2）。在 3.4% (7/205) 的病例中发现了双突变。先前描述的 P25L 变体存在于 8 名患者 (4%) 中。与之前的研究一样，这种变异不被认为是突变，然而，其中 6 例 (75%) 还具有另一种VHL改变。总共 3% (N=7) 的肿瘤表现出编码 SNP，2% (N=4) 具有 IVS 2+43 内含子 SNP。共有 176 个VHL鉴定出突变，包括缺失（34%，N=59）、插入（24%，n=42）、错义（24%，N=42）、无义（10%，N=18）和剪接点改变（ 9%，N=15)。15 个剪接点突变中有 10 个发生在内含子的第一个碱基中，并且都在外显子的 3 个碱基内观察到。外显子突变的发生率为：外显子 1, 37% (N=65); 外显子 2, 34% (N=59); 和外显子 3, 30% (N=52)。肾脏癌的靶向治疗特别行动团队发现似乎影响外显子 2/3 剪接并可能截断密码子 155 下游的蛋白质的改变发生率很高（6%，N=11）。图1A显示VHL基因的改变从密码子 52（缺失）到 213（插入）分布，不包括 P25L 变体。突变的亚型如先前报道的那样分布。

图1:VHL 突变的密码子分布。A、所有突变；B，具有低 RSI 值 (5-30%) 的突变。

表 2：在 205 例组织学证实的透明细胞肾肿瘤中观察到 von Hippel-Lindau (VHL) 基因突变的亚型

病例数（N = 205）			突变数（N = 176）
VHL 状态	ñ	%	类型	ñ	%	突变位置	ñ	%	RSI *斌	ñ	%	数据库	ñ	%
突变	169	82	删除	59	34	外显子 1	62	35	低的	80	45	是的	124	70
1 突变	162	79	插入	42	24	内含子 1	4	2	中等的	92	52	不	52	30
2 突变	7	3	错义	42	24	外显子 2	50	28	高的	4	2
无突变	36	18	无意义	18	10	内含子 2	11	6
P25L ‡	8	4	拼接†	15	9	外显子 3	49	28
沉默子‡	7	3

*突变等位基因与野生型相比的相对信号强度 (RSI)

†剪接突变包括内含子-外显子边界 3 个碱基内的内含子核苷酸变化。

‡ P25L 和沉默突变仅供参考，在未来计算中未归类为功能性突变。

VHL突变状态的确认

重复分析来自一半 VHL 突变病例 (N=20) 和野生型子集 (N=19) 的 20 个突变阳性病例并以盲法评分。除了一个突变外，所有突变都得到确认（95% 的一致性，38/39），并且这种假阳性被排除在后续计算之外。使用高保真聚合酶（不同于第一轮分析）对后半部分病例进行了重新扩增（268/273 个扩增子），并且在所有病例中都确认了VHL突变或野生型状态。由于 DNA 数量有限，五个样本未能扩增且未重复。

相对信号强度 (RSI)

对从正向和反向测序色谱图中平均的突变型和野生型峰高的检查显示，从许多肿瘤扩增的 DNA 中突变型核苷酸的荧光信号显着低于野生型核苷酸峰的荧光信号。图 1 B呈现具有低 RSI 的突变分布。为了计算突变峰高的 RSI，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队对来自正向和反向测序轨迹的峰高的视觉估计值进行平均，除以单个核苷酸位置处存在的总信号（突变体 + 野生型峰）。这些 RSI 估计值分为高 (>60%)、中 (31-60%) 和低 (5-30%) 箱，以估计可能难以使用测序软件分析的突变比例。例如，与总荧光相比，低 RSI bin 中的突变表现出不到 30% 的信号，而从野生型核苷酸中观察到的信号超过 70%。如图所示表 2, 46% 的变体表现出较低的 RSI 值。这些样本代表突变信号很容易被野生型序列掩盖的情况，尤其是在高背景存在的情况下。商业上可用的测序软件对低 RSI 突变的自动检测是不高效的。

通过亚克隆确认等位基因频率

为了确定 RSI 的视觉估计是否反映了原始肿瘤 DNA 中突变等位基因的比例，或者 PCR 和测序是否引入了对野生型的偏倚，来自 10 个含有 RSI 值在 10-50% 之间的突变的肿瘤的 PCR 产物被扩增和亚克隆(表3）。每个肿瘤平均有 48 个亚克隆计数突变和野生型等位基因，每个亚克隆都在两条链上进行测序。通常，通过亚克隆确定的突变等位基因频率同意在视觉 RSI 估计值的 ± 12% 范围内（7/10 例）。五个具有缺失的肿瘤各自具有低于从亚克隆确定的突变等位基因频率的 RSI 值。这可能表明，对于缺失的 RSI 的视觉估计是不正确的，或者，与序列色谱图中的野生型等位基因相比，缺失实际上显示出较低的荧光信号。

表3：通过亚克隆和 RSI 估计的突变等位基因频率的比较*

				突变等位基因频率
肿瘤识别	外显子	肿瘤 DNA 测序†	克隆测序	相对强弱指数 (%) *	克隆‡	(%)
4_1	3	763删除	763 delCTCTACG	20	18/56	32
4_6	2	613 G>T	613 G>T	40	17/48	35
4_8	2	652 A>G	652 A>G	50	21/38	55
4_12	1	469 C>T	469 C>T	40	9/31	29
4_16	2	581删除	581删除	30	21/58	36
4_31	3	IVS2−1 G>A	IVS2−1 G>A	25	3/40	8
4_47	3	752 删除	752 delTCGTCA	30	18/54	33
4_53	2	574 插入	574 delGA	10	20/57	35
4_65	2	570 删除	570 delCAGAGAT	20	24/55	44
4_70	2	665 T>C	665 T>C	30	21/50	42

*突变等位基因的相对信号强度 (RSI) 与总荧光比较

†插入和缺失未在肿瘤 DNA 测序中表征

‡阳性转化子的数量

VHL启动子甲基化

基因失活的另一种机制是通过启动子高甲基化。大多数研究使用甲基化特异性 PCR (MSP)，它依赖于几个 CpG 的甲基化来确定启动子的甲基化状态。与 MSP 一样，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队分析了亚硫酸氢盐处理的 DNA，但设计的引物可同样扩增甲基化和未甲基化的等位基因。为了提供全面的分析，在亚硫酸氢盐处理后，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队使用 Sanger 测序来评估 CpG 中的胞嘧啶位置。VHL的 11 个连续 CpG 中的胞嘧啶（甲基化）：胸腺嘧啶（未甲基化）比率发起人。选择突变阴性 (94%, 34/36) 和阳性 (12%, 21/169) 肿瘤进行分析。17 例 (8.3%, 17/205) 病例具有至少 4 个甲基化 CpG，被认为是高甲基化并可能沉默。所有甲基化病例的VHL突变均为阴性（图 2）。总之，91% (186/205) 的病例通过突变 (82.4%, N=169) 或高甲基化 (8.3%, N=17)表现出潜在的VHL失活。

图 2：突变阴性 (N=16) 和突变阳性 (N=10)透明细胞肾细胞癌DNA 中 11 个 CpG的VHL启动子甲基化分析。每个 CpG 的甲基化状态如下所示：黄色 = 未甲基化，蓝色 = 部分甲基化，红色 = 有效甲基化，阴影框表示 CpG 没有提供信息。每个分析中包含的阳性（甲基化）和阴性（未甲基化）对照显示在底部，VHL突变状态显示在左侧。有效和部分甲基化的 CpG 位点在最右边的列中相加。在 VHL 启动子中具有至少 4 个甲基化 CpG 位点的病例被认为是甲基化阳性。

患者和肿瘤特征的VHL状态

VHL改变随后根据肿瘤组织病理学和患者特征进行分层，总结如下：表 4. 突变病例的总体患病率与所检查的任何肿瘤或患者特征无关，然而，某些突变亚型的患病率是相关的。例如，有远处转移的肿瘤 (M1) 的双突变明显多于没有转移的肿瘤 (M0) (22.2% vs. 2.7%; P=0.003)。无义突变与 Fuhrman 核分级（P=0.03）和淋巴结阳性（P=0.05）相关，并且在 M1 病例中比 M0 病例更普遍（P=0.01）。变化的位置似乎也因组而异。例如，外显子 3 突变在 M1 病例中比 M0 病例更普遍（70.0% 对 25.2%；P=0.01），在有肾癌家族史的病例中（66.7% 对 25.2%；P=0.007）。值得注意的是，所有 6 例具有阳性肾癌家族史的病例都具有含有VHL突变和 4/6 突变 (66.7%) 位于外显子 3。最后，位于外显子 3 的VHL改变的发生率从低 BMI (<25) 受试者的 8.3% 增加到高 BMI 受试者的 25.5% ( >35) (趋势=0.07)。

表 4：与患者描述和临床特征相关的 Von Hippel-Lindau 改变亚型

‡突变总数

*未添加到 205 的亚组是由于缺少临床或风险因素信息

†仅用于比较 M0 与 M1 的 p 值

两组均与无癌症家族史的病例进行比较

∥一级亲属患有癌症或肾癌

泌尿科基因检测与正确治疗讨论

在这项研究中，使用核酸内切酶扫描和荧光 Sanger 测序的新组合分析了来自 205 个组织学证实、宏观解剖的透明细胞肾细胞癌肿瘤的 DNA 的VHL基因改变。当并行应用时，82.4% (169/205) 的透明细胞肾细胞癌病例中检测到突变。这是迄今为止报道的VHL突变的最高流行率，也是在单项研究中分析的组织学证实的透明细胞肾细胞癌肿瘤数量最多的一次。对VHL启动子的详细分析确定了另外 8.3% 的高甲基化和可能沉默的肿瘤。值得注意的是，在这项研究中，甲基化和突变是相互排斥的。总共有 91% 的病例表现出VHL的遗传和表观遗传改变基因。对患者和肿瘤特征的分析表明，突变的总体患病率与通常与疾病进展相关的临床参数无关，但特定的突变亚型与 Fuhrman 核分级、转移、淋巴结阳性和肾癌家族史相关。敏感和正确的突变检测方法（例如此处描述的那些方法）将通过最大限度地减少VHL突变/启动子甲基化状态对病例的错误分类，并降低偏向无效关联的风险，将成为未来研究的一个优势。

之前检查过VHL突变和甲基化的一些最大的研究（93-205 例肾癌病例）报告了较少的VHL基因突变（在 42和 71%)。这些研究利用了单链构象多态性 (SSCP) 和变性高效液相色谱法 (DHPLC) 。正如之前观察到的，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队记录了密码子 65、114、147 和 155 的高流行率，尽管只有 6% 的突变发生在密码子 147/148。突变在外显子中均匀分布，而其他研究报告外显子 1 和 2 的频率更高。最后，本研究中 3.4% (7/205) 的肿瘤显示出两种VHL改变，Banks 等人报告了一个病例 (1%, 1/93)，而大多数其他研究没有报告。VHL 启动子的高甲基化仅在突变阴性肿瘤中观察到，观察到的患病率在先前报道的范围内（分别为 5% 和 17%）。相比之下，一项较早的研究报告说，21% 的肿瘤是高甲基化的，其中一半 (11/19, 58%) 具有VHL突变。这种差异可能是由于用于评估启动子甲基化状态的不同方法或检查的组织学肾癌亚型之间的差异造成的。在这项研究中，一位专家对病例进行了详尽的审查，以确保本研究中包括的所有病例都是组织学证实的透明细胞肾细胞癌的高效性。

一旦使用核酸内切酶扫描和测序鉴定出突变，就会估计 RSI 值以确定使用自动序列分析难以或不可能检测到的比例。为了避免低 RSI VHL突变体的错误分类，来自突变病例子集的 PCR 产物被亚克隆以确认它们的身份。突变状态在 10/10 病例中得到确认，在 10 个肿瘤中的 7 个中，突变等位基因频率从突变阳性转化子的百分比计算得出，与 RSI 视觉估计一致。

为了降低假阴性结果的风险，在提取 DNA 之前，根据对一张 H&E 染色载玻片的病理学审查，对所有冷冻肿瘤活检组织进行宏观解剖以去除正常组织，以获得每个样本至少 70% 的肿瘤组织。出于这个原因，观察到的具有低 RSI 值的高百分比变体 (46%) 是出乎意料的。肿瘤通常含有不同数量的正常组织和细胞。特别是肾肿瘤可以高度血管化。正常组织或血细胞（如淋巴细胞）的肿瘤浸润可降低样本中肿瘤与正常 DNA 的比例。莱恩汉等人检查了七个没有任何可见正常组织的肾癌肿瘤。在肾癌组织的酶促分散后，他们观察到只有 20-50% 是肿瘤细胞（平均 26 ± 15%）。同样，Belldegrun 等人检查了 37 个肿瘤，发现 6-75% 的细胞是肿瘤细胞（平均值为 39 ± 3%）。有理由认为，在这里检查的大约一半肿瘤中，RSI 估计的突变等位基因数量较少，这是因为肿瘤与未通过宏观解剖切除的正常组织的比例较低。与其他类型的肿瘤组织相比，淋巴细胞浸润、血管结构和周围正常组织似乎是肾肿瘤的重要组成部分。患者样本中肿瘤组织与正常组织的污染也可以解释报告中的差异ccRCC 中的VHL突变频率。肿瘤组织中存在大量正常细胞强烈要求应用高度敏感和正确的突变检测方法，例如此处介绍的方法，以确保检测到所有突变。这一结论是基于观察到肾脏癌的靶向治疗特别行动团队用所描述的方法检测到的VHL突变频率超过了所有先前研究中检测到的肾癌VHL体细胞突变频率。

在肾脏癌的靶向治疗特别行动团队完成对透明细胞肾细胞癌癌症基因组中体细胞突变和甲基化的综合分析后，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队将遗传发现与患者的临床和描述特征相关联。对患者和肿瘤亚组中突变流行率的分析表明，总突变流行率与任何检查的参数无关。这一发现与其他研究相似，并支持VHL基因失活可能是ccRCC致癌过程中的早期事件的假设。与之前的一些研究不同，肾脏癌的靶向治疗特别行动团队没有观察到高阶段肿瘤中 VHL 突变/高甲基化的发生率更高肾脏癌的靶向治疗特别行动团队也没有观察到高甲基化或双突变的患病率差异。肾脏癌的靶向治疗特别行动团队确实发现晚期转移性病变比 M0 或 Mx 病例具有更多的双突变、无义突变和位于外显子 3 的突变。肾脏癌的靶向治疗特别行动团队还观察到，无义突变的流行与分级和淋巴结阳性显着相关，并且有肾癌家族史的病例在外显子 3 上的突变明显更多。生存研究将是确定这些分子亚型是否具有任何预后意义所必需的。关联。

个性化医疗的一个目标是识别具有特定改变的肿瘤，这些改变可用于预测患者对治疗的临床反应。最近的一项研究表明，具有VHL甲基化或截短突变的转移性肾癌患者在接受抗血管生成治疗期间肿瘤进展时间延长。肾脏癌的靶向治疗特别行动团队表明，91% 的透明细胞肾细胞癌病例可以通过VHL改变亚型分离肿瘤。这些发现表明，VHL分子亚型可以为病因学、预后和转化研究的组织学相似病例中的透明细胞肾细胞癌肿瘤异质性提供敏感的生物标志物。

Improved identification of von Hippel-Lindau gene alterations in clear cell renal tumors.

Nickerson ML, Jaeger E, Shi Y, Durocher JA, Mahurkar S, Zaridze D, Matveev V, Janout V, Kollarova H, Bencko V, Navratilova M, Szeszenia-Dabrowska N, Mates D, Mukeria A, Holcatova I, Schmidt LS, Toro JR, Karami S, Hung R, Gerard GF, Linehan WM, Merino M, Zbar B, Boffetta P, Brennan P, Rothman N, Chow WH, Waldman FM, Moore LE.

Clin Cancer Res. 2008 Aug 1;14:4726-34. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-4921.

(责任编辑：佳学基因)

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