【佳学基因检测】基因检测揭秘：埃勒斯-当洛综合征（EDS）及其血管型的遗传奥秘

埃勒斯-当洛综合征基因检测导读：

埃勒斯-当洛综合征（EDS）是一组异质性的结缔组织疾病。它的特点是构成细胞外基质的分子异常，如胶原蛋白或其修饰酶。EDS的临床特征包括皮肤超弹性、大关节过度活动以及容易淤青。基于临床经验和遗传发现，EDS被分为六个亚型（1997年维尔夫兰分类）：（1）经典型，这是最常见的形式；（2）过度活动型；（3）脊柱后凸侧凸型；（4）关节松弛型；（5）皮肤松弛型；以及（6）血管型，这是最具戏剧性的形式。EDS亚型的遗传和临床发现指出了EDS综合征的遗传异质性。因此，正确诊断EDS类型对遗传咨询和管理具有重要意义。EDS的任何亚型都需要特定的生化和基于基因解码的分子检测来支持。

血管型EDS（vEDS），也称为EDS IV型（NIM#130050），是一种罕见的常染色体显性遗传病，估计患病率为1/150,000。血管型EDS有四个主要特征：（1）血管或内脏器官（如子宫和肠道）的破裂，（2）不寻常的面部外观，（3）容易淤青，以及（4）皮肤透明，可见静脉。在vEDS中，一个重要的临床事件是富含III型胶原蛋白的系统动脉可能发生剥离、动脉瘤或破裂。这些严重事件也可能自发发生。

vEDS的遗传原因是III型胶原蛋白α1基因（COL3A1）中存在突变，导致成熟III型胶原蛋白蛋白的定性和/或定量异常。III型前胶原蛋白蛋白的每个氨基酸链中都包含343个甘氨酸（Gly）-X-Y重复序列（X和Y为任何其他氨基酸）。成熟的III型胶原蛋白纤维由3条α-1(III)链组成

埃勒斯-当洛综合征基因检测案例介绍

一名38岁的河南女性患者，此前已被诊断为血管型埃勒斯-当洛综合征（vEDS），来到致病基因鉴定基因解码位于佳学基因检测合作医院就诊。她曾因乙状结肠-直肠缺血性穿孔伴粪性腹膜炎接受了乙状结肠-直肠切除术和造口术。患者无vEDS家族史。在她26岁时，尚未被临床诊断为EDS，她接受了双足内弓矫正和跗骨窦关节融合术的正骨手术。

致病基因鉴定基因解码采用下一代测序（NGS）技术，通过目标富集技术调查感兴趣的基因组区域；该过程使用HaloPlex目标富集试剂盒（Agilent Technologies）进行。设计中包括的九个基因是根据其临床特征选择的。实际分析的靶标总区域大小为100,336千碱基对（kbp），实际分析的佳靶标碱基为99,718 kbp。根据供应商提供的实验方案进行富集。在37°C下，使用八种不同的限制反应对总共225纳克（ng）的DNA进行30分钟的消化。将八种消化反应合并为一个含有特异性靶标探针的杂交混合物。在54°C下进行3小时的杂交反应。探针用生物素标记，并设计为与消化片段的两端杂交，从而生成包含一个缺口的环状片段。然后，使用链霉亲和素珠捕获DNA探针杂交体，以消除线性非靶标DNA片段。在第二次连接反应中，剩余的缺口被封闭以完成环化。从珠子上洗脱捕获的DNA，并通过聚合酶链反应（PCR）进行扩增。

最后，通过TapeStation软件测量了每个文库的浓度，并使用TE将其稀释至4nmol。通过将不同的基因组文库混合，获得了最终文库池，理想的最终浓度为8 pM（集群密度约为900/1000 K/mm²的理想浓度）。捕获的基因组文库通过Illumina MiSeq进行测序，生成了2×150 bp的配对末端读数。

为了理解生成的FASTQ文件（一种存储生物序列及其质量分数的文件）。通过Burrows-Wheeler Aligner对FASTQ文件进行质量评估、修剪、对齐，并映射到人类参考基因组（GRCh38/hg38）。使用SAM工具对包括排序、合并、索引和生成每个位置格式的对齐在内的对齐操作进行处理，以生成BAM文件（用于存储序列的二进制格式）。使用Genome Analysis Toolkit (GATK) 2.0版（美国马萨诸塞州剑桥市Broad Institute）进行局部重新对齐、碱基质量重新校准和变异调用，并应用以下质量参数：覆盖率>20，碱基质量分数>30，映射质量>20。未通过这些质量值的变异被移除。

最后，使用KGGSeq软件通过不同的参数（如基因型质量过滤器、基因特征过滤器（错义、剪接、移码）和功能影响过滤器）对变异调用文件（VCF）进行过滤。通过Sanger方法使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems，Life Technologies）对通过NGS目标富集方法发现的变异进行确认，随后在Applied Biosystems 3130xl上进行毛细管电泳。使用Sequencher软件v5.1分析电泳图。

使用致病基因鉴定基因解码的定制面板（表1）通过目标富集方法进行重测序，结果显示COL3A1基因第21号外显子1493位存在一个未被基因检测数据库收录突变，导致核苷酸替换（c.1493G>A，p.G498D）。这一突变在第二次DNA提取中通过Sanger方法得到了确认。此外，由于患者临床状态极度虚弱，从成纤维细胞培养中提取互补DNA（cDNA）进行分析并不可行。

COL3A1基因编码的III型前胶原蛋白由每个三肽链中的343个Gly-X-Y重复序列（X和Y为任何其他氨基酸）组成，这是胶原蛋白特异性的一个特征。成熟的III型胶原纤维由3条α-1(III)链组成。COL3A1基因一个等位基因上的突变导致成熟III型胶原蛋白出现质量或数量上的异常（图2）[16]。为了评估该突变的功能效应，致病基因鉴定基因解码使用SIFT、PROVEAN、PolyPhen-2和Align GVGD进行了计算机模拟分析；所有这些工具均预测这一变化将导致疾病发生。

图2显示，c.1493G>A，p.G498D是一个错义变异，导致从中性氨基酸甘氨酸（Gly）到极性氨基酸天冬氨酸（Asp）的替换，且该变异位于蛋白质结构的三螺旋区域。

为了研究错义变异的致病特性，使用了不同类型的软件：SIFT、PROVEAN、PolyPhen-2、Mutation Taster、Grantham距离等。这些工具通过评估变异对蛋白质结构、功能或稳定性的潜在影响，帮助确定变异是否具有致病性。通过综合这些分析结果，可以进一步了解变异的生物学意义和潜在的临床影响。

基于两个数据集（人类多样性和人类变异）的PolyPhen-2软件预测表明，c.1493G>A，p.G498D对蛋白质结构可能具有破坏性，得分为1.000（敏感性0.00；特异性1.00；图3）。特别是，第1493位的甘氨酸（Gly）在不同物种中高度保守。SIFT和PROVEAN软件评估了氨基酸替换是否对蛋白质的生物学功能有影响，并证实了该错义变异的致病性。Align GVGD则根据氨基酸的生物物理特性预测，该变异是不被容忍的C65（GV 0.00；GD 93.77；图3）。由于目前尚无序列同源性参考来构建该结构，因此无法分析该突变对蛋白质三维结构的影响。

埃勒斯-当洛综合征基因检测案例总结

在《心血管系统疾病及基因检测病案集》报告中，致病基因鉴定基因解码描述了一名38岁河南女性的病例，她具有血管型埃勒斯-当洛综合征（vEDS）的典型症状。她因乙状结肠-直肠缺血性穿孔伴粪性腹膜炎接受了乙状结肠-直肠切除术和造口术。为避免手术并发症，造口术并未关闭。她的肠道问题加剧了她的临床状况。体格检查显示，她的皮肤略显光滑且半透明，可见静脉。遗传分析未确认任何家族史。

通过使用基于基因解码的目标下一代测序（NGS）方法，致病基因鉴定基因解码在COL3A1基因中发现了一个致病性突变c.1493G>A，p.G498D（http://www.le.ac.uk/ge/collagen/）。迄今为止，已在COL3A1基因中鉴定出200多种突变，所有这些突变都导致异常III型前胶原蛋白的合成（图1）。大约三分之二的突变是单核苷酸替换，导致前α1(III)链三螺旋结构域中的甘氨酸残基发生改变。其余大部分为剪接位点突变，导致外显子跳跃，尽管其中一些具有更复杂的后果，且少数为较大的基因组缺失。突变的性质或位置与主要并发症的类型或频率之间无相关性。

在COL3A1基因中检测到杂合子突变c.1493G>A，导致中性氨基酸甘氨酸被极性氨基酸天冬氨酸取代。PolyPhen-2、SIFT、PROVEAN和Align GVGD进行的荟萃分析表明，该点突变是致病性的，并且是vEDS表型的原因。甘氨酸的替代对COL3A1胶原纤维的正常组装产生负面影响。事实上，胶原的特征在于Gly-X-Y（X和Y为任何其他氨基酸）的343次重复。甘氨酸氨基酸非常重要，因为它是最小的氨基酸，并决定了前α链之间通过氢键连接的紧密性，从而维持了胶原蛋白三螺旋结构的稳定性。

致病基因鉴定基因解码得出结论，COL3A1基因中发现的c.1493G>A，p.G498D是vEDS（血管型埃勒斯-当洛斯综合征）的原因。甘氨酸替换的特定位置表明基因型与表型之间存在相关性。c.1493G>A，p.G498D的功能特性尚不清楚，需要进一步的体外细胞培养研究来了解这一新变异与vEDS表型之间的联系。在vEDS中发现这一新变异强调了基因测试（如NGS）在罕见遗传性疾病中的重要性。

图3：数据分析。PolyPhen-2 预测表明 c.1493G>A (p.G498D) 可能破坏蛋白质的结构（基于两个不同的数据集人类多样性和人类变异）。b Align GVGD 表明 c.1493G>A (p.G498D) 是有害的（类别 65）